炎性肠病(IBD)是广泛影响健康的疾病之一，病理特征是结肠的粘膜及粘膜下层存在大量的炎症细胞浸润，产生大量炎症因子和趋化因子。这被认为是导致神经系统过兴奋，出现胃肠道功能紊乱的主要因素之一。 迷走神经运动背核区(DMNV)位于延髓背核，整合着不同来源的外周和中枢信号，通过迷走神经提供副交感神经信号，调节胃肠道活动。DMNV发出外在神经，支配胃肠道功能，而外在神经系统在胃肠道功能紊乱与IBD之间的作用尚不清楚。 以往认为，DMNV是控制生命基本的中枢神经核团，被严密保护且对周围环境变化反应不敏感。目前认为IBD产生的炎症因子可以对DMNV区有一定的功能；DMNV能够感受周围系统环境的变化而产生反应。DMNV对系统的内毒素反应，提示着DMNV本质上缺乏血脑屏障的保护，具有脑室周围组织的特点；DMNV区发出神经突渗入室管膜层进入第四脑室底部，提示DMNV同时监控着血循环和脑室液的变化；TNBS诱导的大鼠结肠炎模型也证实血脑屏障的渗透性升高；特异性饱和转运TNF—α和IL-1β进入神经系统也得到证实。DMNV在促炎症因子环境中，特别在急性肠道炎症后，可以产生对胃肠道功能的影响。 炎症介质是IBD诱导胃肠道功能紊乱的潜在因素。蛋白酶激活受体(PARs)是G—蛋白配对家族成员，有四个亚型，PAR-1和PAR—3被血栓素激活，PAR—2被胰蛋白酶和类胰蛋白酶激活；PAR—4分别被血栓素和胰蛋白酶激活。PARs存在于许多组织和各种细胞中，与细胞的损伤和炎症反应相关。 上皮细胞，肠肌层神经元和胶质细胞都证实，PAR-1和PAR—2激活后通过G蛋白介导，激活钙信号通路，增加细胞内钙离子浓度；在缺乏细胞外钙离子的也升高。PAR受体特异性激活类似物PARP-1和PARP—2也有相似作用。PARs的N端分开激活受体，是导致受体失敏感的机理。PARs对DMNV的具体功能不清楚。PAR-1存在于神经元和神经胶质细胞中表明PAR-1在神经组织中除了血管再形成作用外，还有其他的生理功能。PAR—2激活被认为是机体在炎症和过敏状态下蛋白激酶的释放，肠壁内炎症因子的产生。 α—黑素细胞刺激素(α—MSH)除了黑色素细胞合成功能有关外，还是一种内源性的神经免疫调节肽，具有抗炎性细胞因子的效应及影响能量代谢，是神经、免疫与内分泌系统之间传递信号的一种分子，在基础研究与临床治疗中都具有重要价值。α—MSH对几乎所有类型的炎症都有强大的抑制作用，可通过中枢、外周在多种内分泌、免疫调节系统发挥作用。小剂量中枢应用α—MSH可抑制外周炎症介质引发的炎性反应。α黑素细胞刺激素类似物(α—NDP—MSH)延长了α—MSH的作用时间，具有明显抗炎作用相广泛用于实验和临床中。在中枢神经细胞MC4R可以通过激活钙离子通道和ERK1/2通路磷酸化分别发挥一定的生理作用。 第一部分炎症性肠病大鼠模型的建立及蛋白酶激活受体在其结肠组织中表达 目的：研究TNBS诱导IBD的大鼠模型制备以及了解IBD大鼠的结肠组织中PAR受体家族存在的情况。 方法：肛门灌注TNBS用7天造模。7天后疾病活动情况的评估；组织学损伤的评估；髓过氧化物酶活性试验以及实时定量荧光PCR检测方法。 结果：实验7天时两组体重比较分别为239±17.77克；161.5±5.19克，P<0.05；实验组体重减少22.9±4.6克；对照组增加60.65±14.63克；实验期间每日两组大鼠进食为5.4±2.0克，23.46±4.1克；P<0.01。TNBS—组大鼠DAI评分明显低于对照组大鼠的平均DAI评分分别为8.8分和0.2分。TNBS实验组结肠重量相比对照组，全结肠毛重量分别为20.74±1.9克，10.32±1.1克；结肠重量分别为4.849±0.89克，3.2±0.22克距肛门8CM的结肠重量分别为1.93±0.37克，1.0±0.34克；P<0.05。TNBS组大鼠结肠炎组织学损伤评分为6.3分，明显高于对照组的1.3分，P<0.05。实验组大鼠炎症肠段的MPO平均活性4.2±0.7U/1cm结肠；对照组1.08±0.09 U/1cm结肠；P<0.05。各实验组大鼠上述两种PAR-1mRNA，PAR—2 mRNA均显著上升，分别为317.0±53.86％，354.9±97.48％；相比对照组大鼠的PAR-1 mRNA，PAR—2 mRNA水平为81.25±13.30％；83.50±24.42％，P<0.05。 结论：TNBS可以制备出IBD大鼠模型。TNBS诱导的IBD大鼠模型的结肠组织中存在着PAR-1 mRNA和PAR—2 mRNA水平升高，提示着PARs受体的激活在IBD的炎症过程起着一定的作用。 第二部分 TNBS诱导大鼠炎症性肠病模型迷走神经运动背核区中病理及蛋白酶激活受体的变化 目的：本研究中通过逆行追踪技术研究TNBS诱导IBD大鼠模型后对于DMNV的影响，以及在DMNV神经细胞中PAR-1和PAR—2的存在情况。 方法：采用逆行追踪技术DiI染色逆行染色DMNV及DMNV片荧光镜观察；实时定量荧光PCR比较BD模型DMNV组织中PAR-1 mRNA和PAR—2 mRNA检测。 结果：正常组中近AP区约5.7±1.6/组织切片，IBD组近AP区约0.5±0.4/组织切片，P<0.01：尾部区约6.6±1.4/组织切片，IBD组尾部区约1.4±+0.2/组织切片，P<0.01。IBD的DMNV组织中PAR-1mRNA是正常组织中的1.74±0.32倍，PAR—2mRNA是正常组织中的1.89±0.45倍。 结论： TNBS诱导的IBD大鼠模型导致DMNV神经细胞DiI的染色数目减少，提示着IBD后DMNV神经细胞可能出现一定的病理改变，但改变的意义不知道。在大鼠DMNV组织中存在PAR-1和PAR—2受体。在DMNV神经细胞中PAR-1和PAR—2起着一定的激活作用。 第三部分蛋白酶激活受体对炎症性肠病诱导的神经损伤及α—黑素细胞刺激素对IBD诱导神经损伤的保护作用 3.1 PAR-1和PAR—2受体激活对于大鼠原代DMNV细胞钙离子通路影响及作用研究 目的：本研究通过原代DMNV细胞培养后，针对PAR受体发挥作用的常见的钙离子通路进行研究，以了解PAR受体激活后作用的途径和意义 方法：采用大鼠原代DMNV神经细胞培养；单细胞荧光染色后钙离子内流测定和ELISA法细胞凋亡和增殖实验。 结果：用Thrombin，PAR-1类似物和Trypsin，PAR—2类似物处理大鼠DMNV原代神经细胞可激发细胞钙离子内流。一定剂量范围内激发细胞钙离子内流的剂量相关性变化。重复Thrombin和Trypsin处理可激发细胞钙离子内流，但明显低于第一次处理后；Thrombin，PAR-1类似物和Trypsin，PAR—2类似物在缺乏细胞外钙离子时也可激发细胞钙离子内流；但在预先使用U73122处理后可以明显降低Thrombin和Trypsin激发细胞钙离子内流。2APB预处理后可以明显降低Thrombin，PAR-1类似物和Trypsin，PAR—2类似物激发细胞钙离子内流的最大值。 ELISA法Thrombin和Trypsin处理浓度升高后原代DMNV细胞出现凋亡比例上升趋势，且和浓度呈相关性；增殖被抑制的比例逐渐加重，并与其浓度相关；坏死比例上升趋势，且和浓度呈相关性。 结论：Thrombin，Trypsin对于原代DMNV细胞的存在导致凋亡坏死和抑制细胞增殖的作用。PAR-1和PAR—2在原代DMNV细胞中可以激发细胞钙离子内流。 3.2α—黑素细胞刺激素对于原代DMNV细胞钙离子通路影响以及PAR损伤后的保护作用 目的：本研究以体外培养的大鼠原代DMNV细胞为对象，探讨α—MSH有无抑制PAR受体激活后产生的对于DMNV的凋亡作用以及α-MSH的可能抗炎机制。 方法：采用体外大鼠原代DMNV细胞培养以及[Ca2+]i测量：实时荧光定量PCR；Western blotting；ELISA细胞凋亡实验；ELISA细胞增殖实验等方法进行研究。 结果：正常大鼠DMNV组织中存在MC4R mRNA的表达；α-NDP-MSH可以促进原代DMNV细胞ERK1/2信号通路磷酸化；MC4R激活可以促进原代DMNV细胞钙离子内流；NDP-MSH可以降低Trombin和Trypsin处理原代DMNV细胞的凋亡作用。 结论：α-黑素细胞刺激素可以激发原代DMNV神经细胞钙离子内流且反应存在着剂量相关效应；α-黑素细胞刺激素激活钙离子内流是通过PLC的参与，导致IP3动员而释放细胞内流钙离子库；α-黑素细胞刺激素可以促进原代DMNV神经细胞ERK1/2磷酸化升高，降低PARs对于原代DMNV细胞的凋亡的作用。