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背景： 神经系统自身免疫性疾病是以免疫细胞、免疫分子等攻击神经系统为主要病理机制的疾病,可发生于中枢、周围神经系统及神经-肌肉接头等处,导致神经元或轴索损伤、髓鞘脱失、神经-肌肉接头处破坏等病理改变.在许多神经系统疾病中,免疫细胞以原发性和继发性的炎性成分浸润神经系统.神经-免疫间相互作用和影响,依赖于产生相互作用的网络或通路的组成成分.许多实验早已表明中枢神经系统的炎性反应导致或加重组织损伤.既往大量研究表明,在免疫系统中不同细胞的联系主要通过细胞因子的介导.肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一类主要由单核、巨噬细胞产生的炎性细胞因子,在免疫应答、免疫调节和多种免疫相关疾病的发生、发展和转归中起着非常重要的作用.因此,抑制局部TNF-α的表达是促进神经免疫损伤修复的可选方法之一.然而目前TNF-α抑制剂稳定性较差,不能进入血脑屏障,价格十分昂贵限制了它们在临床上的应用,所以,通过RNA干扰技术抑制神经免疫疾病中TNF-α的表达成为可供选择的方法之一. RNA干扰能够特异性抑制靶基因的表达,从而具有治疗因基因过表达或突变引起疾病的应用前景.microRNA能引起RNA干扰现象,microRNA-155(miR-155)对炎性细胞的发育、分化以及炎性介质的表达和释放等有重要的调节作用,影响机体炎性反应过程和结果,可通过调节细胞因子在哺乳动物免疫系统发挥重要作用. RNA干扰技术的关键步骤之一就是将基因转染进入细胞的技术.基因转染载体主要分为病毒载体和非病毒载体两大类.由于病毒载体潜在的安全性问题,很大程度限制了其在体内实验中的应用.非病毒载体因转染效率高,重复性好,操作简单,价格较病毒载体低廉,并且安全性良好而引人瞩目.包括阳离子聚合物,如聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)和阳离子脂质体,如Lipofectamine2000(Lipo2000). 目的： 1.通过比较两种非病毒载体介导miR-155转染人类急性单核-巨噬白血病细胞(THP-1)的转染效率和转染后死亡率,证实阳离子聚合物PEI能较好地介导miR-155转染THP-1细胞. 2.通过PEI介导miR-155转染THP-1,并建立炎症/免疫异常细胞模型,探究miR-155在THP-1细胞及炎症/免疫异常细胞中对TNF-α细胞因子的调控作用.为神经系统中炎症/免疫反应提供基因治疗方法. 内容： 本研究的内容主要分为两部分: 一.两种非病毒载体作为miR-155基因传输载体的实验研究 方法： 1.非病毒载体介导FAM标记的microRNA转染. 取对数生长期的THP-1细胞以完全培养基培养.实验分为4组:①空白组CON:不加转染试剂,不加miRNA;②空白转染组NC:不加转染试剂,只加miRNA;③Lipofectamine2000转染组:用Lipofectamine2000/miR-155复合物转染;④PEI转染组:用PEI/miR-155复合物不同N/P比值进行转染.PEI/miR-155复合物按照不同的N/P比值分为60:1、50:1、40:1、30:1、20:1和10:1组,避光转染后24h,以DAPI(10μg/ml)、PI染色(40μg/ml),在荧光镜下观察各组转染效果以及DAPI和PI染料的染色效果. 2.流式细胞仪检测各组microRNA转染效率及细胞死亡数: 转染后于24h用流式细胞仪分别检测转染效率及细胞死亡数,筛选出转染效率最优体系.每组实验重复3次结果取平均值. 3.microRNA转染后在THP-1中的表达 用上述实验筛选出转染效率最优体系,按此体系转染miR-155mimic和miR-155inhibitor.转染24h后作q-PCR检测各组miR-155在细胞内的相对表达量.每组实验重复3次结果取平均值. 4.统计学处理 计量资料以x±s表示,采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析.两组间比较用t检验,采用one-way ANOVA方差齐性检验,多组间两两比较用Bonfcrroni法.P<0.05为具有统计学差异. 结果： 1.荧光镜下观察转染效率和死亡率: 可见lipo组与PEI组转染后,均有带荧光的细胞;随着PEI与microRNA的N/P比值逐渐下降,带有荧光的细胞数量逐渐减少.两组细胞中荧光主要分布在细胞质中,也有分布于细胞核内;PI染色后,lipo组转染细胞死亡数比PEI组转染的细胞死亡数多. 2.流式细胞仪检测不同组别转染效率和死亡率: 转染率中lipo组和PEI各组转染效率明显高于空白组和空转组;PEI组N/P为30:1、50:1、60:1组转染效率均明显高于lipo组;PEI组N/P为10:1、20:1死亡率明显低于lipo组;PEI组N/P为50:1、60:1死亡率明显高于lipo组.根据以上结果,筛选出PEI组的N/P值30:1为最优转染体系. 3.转染miR-155的模拟物和抑制物(mimics和inhibitor)后THP-1细胞内miR-155的相对表达量: 以实验优化的转染体系:PEI/microRNA为N/P=30转染miR-155mimics后,miR-155在细胞内的相对表达量(4.37±0.75)明显高于空转组(1.32±0.70);转染miR-155inhibitor后,miR-155在细胞内的相对表达量(0.23±0.044)明显低于空转组(0.56±0.14),P<0.05. 结论： PEI是一种价格低廉、低毒性、高效率的基因转染载体,能有效介导miRNA分子转染进入THP-1细胞,从而介导miR-155在细胞内的过表达和抑制,可进一步用于细胞模型或动物体内进行联合基因治疗的实验模型. 二.PEI介导miR-155的转染对细胞因子TNF-α的调控作用 方法： 1.过表达和抑制miR-155对THP-1内细胞因子TNF-α的影响 分别转染PEI/miR-155mimics与PEI/miR-155inhibitor复合物到THP-1细胞,转染后24小时,作q-PCR检测TNF-α在细胞内的表达;提取细胞上清液,作ELISA检测各组细胞释放TNF-α的蛋白浓度. 2.LPS诱导THP-1细胞建立炎症/免疫异常细胞模型 分别以LPS(1μg/ml)刺激THP-1细胞3小时、6小时、12小时、24小时,刺激后收取各组上清,作ELISA检测各细胞培养液中TNF-α的蛋白浓度,后作q-PCR检测TNF-α在细胞内的表达. 3.抑制miR-155表达对LPS诱导的炎症/免疫异常细胞模型表达TNF-α的影响 预先转染PEI/miR-155inhibitor复合物到THP-1细胞,转染后24小时,以1μg/ml脂多糖(LPS)分别刺激细胞6小时、12小时.抽提细胞总RNA,作q-PCR检测TNF-α在细胞内的表达.提取细胞上清液,作ELISA检测各组细胞释放TNF-α的蛋白浓度. 结果： 1.过表达miR-155:转染PEI/miR-155mimics24小时后THP-1细胞TNF-α的基因相对量(2.46±0.15)明显高于对照组(1.14±0.11),且前者上清液中TNF-α的浓度(152.74±5.10)pg/ml明显高于对照组(122.27±6.75)pg/ml(P<0.05);抑制miR-155:转染miR-155inhibitor24小时后THP-1细胞TNF-α的基因相对表达量(0.64±0.03)明显低于对照组(2.52±0.40),P<0.05,前者上清液中TNF-α的浓度(118.85±4.36)pg/ml与对照组(114.02±10.98)pg/ml未见明显差异,P>0.05. 2.以LPS(1μg/ml)刺激THP-1细胞3小时、6小时、12小时、24小时后,THP-1上清液中TNF-α浓度分别为(1679.77±47.73)pg/ml、(1590.29±59.67)pg/ml、(1036.71±69.57)pg/ml、(970.64±50.27)pg/ml,均明显高于对照组(61.98±18.91)pg/ml,P<0.05.其中LPS刺激3小时与6小时TNF-α浓度无明显差异,刺激12小时和24小时TNF-α浓度无明显差异. 结论： 1.PEI介导过表达miR-155的THP-1细胞TNF-α的基因相对表达量和释放浓度均高于对照组.PEI介导抑制miR-155的THP-1细胞TNF-α的相对表达量低于对照组,但细胞释放TNF-α的浓度与对照组无明显差异. 2.LPS可诱导THP-1细胞释放TNF-α,在不同时段测得细胞上清液TNF-α浓度不同,均明显高于对照组,初步建立炎症/免疫异常细胞模型. 3.经抑制miR-155预处理后,在LPS诱导的炎症/免疫异常细胞模型中,细胞TNF-α的基因相对表达量均较未预处理组下降.预处理后LPS诱导12小时,细胞释放TNF-α的浓度较未预处理组明显下降.miR-155在炎症免疫中对TNF-α细胞因子可能存在调控作用,有望成为神经免疫的基因治疗靶点.