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研究背景视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma,RB）是儿童最常见的原发性眼内恶性肿瘤,在新生儿中的发病率为1/16000-18000,每年在全世界范围内约有9000例新发病例,其中大部分发病年龄在5岁以前。目前对RB的治疗方法主要有化疗（静脉、动脉、眼内注射）、放疗、TTT、眼球摘除等,尤其是化疗在RB的保眼治疗中占有主导作用。眼内注射化疗对玻璃体内种植的肿瘤具有较好的疗效,并且对眼球以外的组织没有副作用,然而,眼内注射的化疗药物难以进入肿瘤内部,同时,该方法在治疗时需多次进行眼内注射,增加了眼内感染的风险。因此,寻找一种更安全有效的RB眼内注射化疗药物是临床治疗中的迫切需求。研究表明,纳米药物通过EPR作用更容易进入肿瘤组织内部,选择性杀灭肿瘤细胞,减少对正常组织的损害,此外,纳米药物还具有较好的水溶性和生物相容性,可在体内长期稳定释放等优点,进而可减少给药频率和有创操作,提升治疗依从性,是一种极具潜力的适用于RB眼内注射治疗的新型药物。然而,以非活性辅料作为载体的纳米药物载药量低,制备工艺复杂,成本较高。为解决上述缺点,以两种不同抗肿瘤机制的活性药物制备而成的纳米制剂不仅载药量高,而且具有协同抗肿瘤作用,抗肿瘤效率得到显著提高。多柔比星（Doxorubicin,DOX）是一类在临床上广泛使用的蒽环类抗癌药物,广泛用于各种纳米药物的制备。宾达利（Bindarit,BIN）是一种具有抗炎作用的吲哚类衍生物,可以抑制单核细胞趋化蛋白（MCP-1）的合成,减少肿瘤相关巨噬细胞的浸润,对肿瘤的进展和转移有潜在的抑制作用。DOX与BIN具有不同的抗肿瘤机制,从化学分子结构上分析发现两者之间可能存在氢键和π-π堆积作用,然而,BIN能否负载DOX仍需进一步验证。近年来,分子对接、分子间作用力计算和耗散粒子动力学（DPD）模拟等计算机模拟辅助技术可预测不同药物之间的分子间相互作用,模拟纳米复合物的组装过程,可用于纳米药物的设计与验证。我们利用DOX与BIN进行了从原子到介观维度的计算机模拟实验,以此为基础采用透析法成功制备多柔比星/宾达利纳米粒（DOX/BIN NPs）,研究其表征特点以及对视网膜母细胞瘤Y79细胞的抑制作用,为RB眼内注射化疗提供一种具有潜力的新方案。研究目的:本研究拟通过计算机模拟辅助技术和细胞实验,探讨DOX/BIN NPs对视网膜母细胞瘤Y79细胞的抑制作用,为RB眼内注射治疗提供一种具有潜力的新方案。第一部分通过计算机模拟辅助设计构建以BIN作为载体的新型DOX纳米粒,研究DOX/BIN NPs的组装过程及分子间作用力;第二部分以透析法制备DOX/BIN NPs,探讨其表征特性;第三部分重点研究DOX/BIN NPs对视网膜母细胞瘤Y79细胞抑制作用,以及通过小鼠巨噬细胞Raw 264.7细胞研究DOX/BIN NPs对MCP-1的抑制能力。研究方法:1、计算机模拟辅助技术设计构建纳米颗粒,利用Autodock分子对接、分子间混合能和DPD介观模拟等计算机模拟辅助技术研究DOX/BIN NPs组装过程及分子间作用力。2、检测DOX/BIN NPs粒径、zeta-电位、载药量、紫外光谱、红外光谱、3D荧光光谱,研究其表征特性。3、体外释放实验研究在不同PH条件下（PH=5.8、6.5、7.4）DOX/BIN NPs对DOX以及BIN的长期稳定释放能力。4、研究Y79细胞对DOX/BIN NPs和小分子DOX的摄取能力。5、CCK-8细胞毒性实验研究DOX/BIN NPs和小分子DOX对Y79细胞和ARPE-19细胞的毒6、通过Elisa实验研究DOX/BIN NPs和小分子BIN对Raw 264.7细胞分泌MCP-1的抑制能力。结果:1、DOX与BIN之间的分子间相互作用力主要由π-π堆积作用和氢键组成,在其介导下,DOX与BIN可形成稳定的DOX/BIN复合物。2、DOX和BIN在水中可以组装成球型纳米粒,纳米粒内部主要由DOX组成,外部包裹着BIN。以透析法制备的DOX/BIN NPs溶液外观呈浑浊的橙色,有颗粒感。3、DOX/BIN NPs粒径为234 nm,zeta-电位为31.6 m V。DOX/BIN NPs的DOX载药量为21.36%±2.03%,包封率为66.97%±17.62%。DOX/BIN NPs紫外光谱吸收峰在505 nm和290 nm处。DOX/BIN NPs红外光谱发现在3316 cm-1处未见吸收峰,在1580 cm-1处、989 cm-1处以及739 cm-1处峰值下降。DOX/BIN NPs的3D荧光检测发现水中没有明显的荧光吸收峰。4、DOX/BIN NPs在体外具有长期稳定释放特性,呈PH依赖性。5、DOX/BIN NPs组相对于DOX组更易于被Y79细胞摄取,细胞内DOX/BIN NPs含量显著高于小分子DOX（P＜0.0001）。6、DOX/BIN NPs对Y79细胞的细胞毒性随着浓度增加不断增加,且DOX/BIN NPs对Y79细胞的细胞毒性低于小分子DOX,差异显著（P＜0.05）;DOX/BIN NPs对ARPE-19细胞的细胞毒性低于小分子DOX,在50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml时差异显著（P＜0.05）,在25 ng/ml时无明显差异（P＞0.05）。7、DOX/BIN NPs组和小分子BIN组均可显著抑制Raw 264.7细胞分泌MCP-1（P＜0.01）,而DOX/BIN NPs组和小分子BIN组组间并无差异（P＞0.05）。结论:我们通过计算机模拟辅助设计发现DOX和BIN可在水中组装成球形的DOX/BIN NPs,其分子间相互作用力主要由π-π堆积作用和氢键组成,DOX/BIN NPs可在体外长期稳定释放,呈PH依赖性,且更易于被Y79细胞所摄取,其对Y79细胞和ARPE-19细胞的细胞毒性相对小分子DOX较低,具有较好的安全性,另外,DOX/BIN NPs还可抑制Raw 264.7细胞分泌MCP-1,综上所述,我们的研究初步说明DOX/BIN NPs对RB表现出较好的抗肿瘤作用以及安全性,具有用于RB眼内注射治疗的潜力。