1.1研究背景肝脂肪变性与肥胖、代谢综合征和2型糖尿病等疾病息息相关。肝脏脂质的蓄积主要是脂肪酸代谢平衡失调导致的,研究肝细胞甘油三酯的代谢具有重要意义。色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)是具有抑制血管增生,神经营养保护和抗肿瘤等多种功能的蛋白。最近研究发现2型糖尿病、肥胖和代谢综合征人群的外周血中PEDF水平较正常人群显著上调,但其作用并不明确。以往研究PEDF的功能主要集中在分泌型PEDF,其细胞内功能却研究得非常少。脂肪甘油三酯脂解酶(adipose triglyceride lipase, ATGL)是调控甘油三酯降解的关键酶,有报道PEDF能够通过与ATGL目互结合,促进脂肪细胞的脂肪分解。因此,本研究通过构建信号肽缺失的PEDF (mPEDF)过表达载体,让PEDF只在细胞内表达,以研究细胞内PEDF参与甘油三酯代谢的作用及其分子机制；同时建立高脂诱导的肥胖合并脂肪肝模型以观察肝脏PEDF在脂肪肝发生过程中的变化情况。1.2研究目标本研究主要探讨脂肪肝发生过程中肝脏PEDF的表达变化情况,证明PEDF存在细胞内的分布和作用,并探讨细胞内PEDF调控甘油三酯降解的作用和分子机制。1.3研究结果(1)成功建立了高脂饮食诱导的肥胖合并脂肪肝小鼠模型。高脂饮食8周后,小鼠体重增加了54%,H&E和苏丹Ⅲ染色证明脂肪肝的发生。肝脏甘油三酯水平检测发现高脂组甘油三酯含量是普通组的3倍多。(2)肝脏PEDF在高脂饮食诱导的肥胖小鼠Pdb/db小鼠是下调的。荧光定量PCR技术和Western Blot方法检测高脂组肝脏PEDF的nRNA和蛋白水平在4,8和12周较普通组上调,而16和20周显著下调。db/db小鼠肝脏PEDF较对照组明显下调。体外实验证明油酸处理下调肝细胞PEDF。(3)细胞内的PEDF定位于细胞浆,外源性的PEDF能够被细胞摄取。免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察证明细胞内PEDF主要存在于胞浆,FITC标记实验证明外源PEDF可以被细胞摄取进细胞内。(4)细胞内PEDF促进甘油三酯降解。构建了mPEDF和PEDF稳定表达的HeLa细胞株,用尼罗红染色和共聚焦显微镜观察证明mPEDF和PEDF均促进甘油三酯降解,下调脂类结合蛋白Perilipin2的表达和促进甘油释放。(5)mPEDF同PEDF均能与ATGL结合。免疫共沉淀方法证明ATGL能够结合mPEDF和PEDF,且PEDF重组蛋白(rPEDF)能与ATGL结合PEDF信号肽不影响PEDF与ATGL的结合。(6)ATGL介导PEDF调控甘油三酯降解的作用,GOS2过表达抑制PEDF促进甘油三酯分解。ATGL基因沉默和GOS2过表达抑制PEDF促进甘油释放的作用,ATGL过表达促进PEDF的作用。(7) mPEDF和PEDF均能增强ATGL与GOS2的结合,且促进二者转位到脂滴表面。双分子荧光互补实验(BiFC)证明1nPEDF和PEDF均促进ATGL-GOS2转位到脂滴表面。BiFC实验和免疫共沉淀证明mPEDF和PEDF均增强ATGL与GOS2的结合。(8) PEDF结合于ATGL的C端(268-504氨基酸),且能同时与ATGL和GOS2结合。ATGL片段缺失载体过表达和免疫共沉淀方法证明PEDF结合与ATGL的C端(268-504氨基酸)(9)内源性PEDF参与肝细胞甘油三酯调控,且能与ATGL的结合。siRNA介导的内源性PEDF基因沉默和mPEDF, PEDF过表达证明细胞内PEDF调控肝细胞甘油三酯降解。免疫荧光染色和免疫共沉淀证明内源性PEDF与ATGL存在相互结合。(10)PEDF下调肝细胞GOS2的表达。体内体外实验和干扰肝细胞PEDF证明PEDF下调GOS2的转录水平。1.4结论和意义肥胖小鼠肝脂肪变性时PEDF水平是下调的。细胞内PEDF通过与ATGL的C端相互结合,促进ATGL和GOS2的转位到脂滴表面,分解甘油三酯；同时PEDF通过下调GOS2的表达,抑制甘油三酯的蓄积。本研究为脂肪肝的预防和治疗提供新的线索。2.1研究背景脂肪组织是能量的储存库,同时也是调控机体能量稳态的内分泌器官。脂肪组织功能的失调可能导致外周循环中的游离脂肪酸升高,脂肪异位沉积到肝脏和骨骼肌等非脂肪器官,最终可能导致胰岛素抵抗和2型糖尿病。ATGL是调控甘油三酯分解的关键酶,决定着血浆游离脂肪酸的基础水平。肥胖和胰岛素抵抗的人群和鼠类的脂肪组织ATGL水平普遍下调,而血浆游离脂肪酸却是升高的,这一矛盾背后的机制并不清楚。PEDF是个多功能蛋白,临床资料分析表明肥胖,代谢综合征和2型糖尿病患者血浆PEDF水平较正常人明显升高,提示PEDF可能参与脂肪组织代谢调节。体内实验发现肥胖血浆的PEDF主要由脂肪组织合成和分泌,PEDF通过ATGL促进脂肪分解,诱导脂肪异位沉积,导致胰岛素抵抗。但PEDF对ATGL是否有直接调控尚不清楚。本研究通过建立高脂饮食诱导的肥胖模型,观察高脂饮食各个时间点脂肪组织PEDF和ATGL水平的变化情况,再检测PEDF对脂肪组织ATGL的直接调控作用和可能的分子机制。2.2研究目标本研究主要探讨肥胖发生过程中脂肪PEDF和ATGL的表达变化情况,证明PEDF对脂肪组织ATGL的直接调控作用,并探讨PEDF调控ATGL的分子机制,解释持续肥胖和基础脂肪分解增强的矛盾现象。2.3研究结果(1)高脂饮食上调脂肪组织PEDF和下调脂肪组织ATGL水平。荧光定量PCR技术和Western Blot方法发现高脂组各个时间点(4、8、12、16和20周)脂肪组织PEDF的mRNA和蛋白水平较普通组均上调,而ATGL的蛋白水平在各个时间点均是下调的。(2) PEDF下调脂肪细胞ATGL的蛋白水平。Western Blot方法检测发现PEDF长期给药和短期给药均下调小鼠脂肪组织ATGL的蛋白水平。PEDF抗体拮抗上调肥胖小鼠脂肪组织的ATGL水平。体外细胞实验发现PEDF下调分化成熟的3T3-L1细胞的ATGL蛋白表达,对ATGL的mRNA水平没有影响。(3) PEDF促进ATGL蛋白发生泛素-蛋白酶体介导的降解。放线菌酮阻断实验发现ATGL的半衰期大约为69min,蛋白酶体抑制剂MG132处理和Co-IP方法证明ATGL蛋白降解是经由泛素化介导的蛋白酶体降解途径。(4) PEDF促进脂肪组织基础脂肪分解。体内和体外实验都证明PEDF促进脂肪细胞的基础脂肪分解,但不能促进ISO刺激下的脂肪分解,抗体拮抗PEDF下调肥胖小鼠的血浆游离脂肪酸。(5)ATGL介导PEDF促进的脂肪分解。应用ATGL的抑制剂bromoenol lactone在体外细胞实验上阻断PEDF促进脂肪分解作用。PEDF下调ATGL抑制因子GOS2和脂类结合蛋白Perilipin1的表达。2.4结论和意义PEDF对ATGL存在双向调控作用,即肥胖发生过程中,脂肪组织上调PEDF表达和分泌,血浆高水平PEDF一方面通过促进脂肪组织ATGL发生泛素-蛋白酶体介导的降解,导致甘油三酯在脂肪组织的进一步蓄积；一方面通过激活ATGL维持肥胖状态下的基础脂肪分解,最终导致持续肥胖和胰岛素抵抗。我们的研究解释了肥胖过程中持续肥胖和基础脂肪分解增强之间的矛盾现象,为肥胖和胰岛素抵抗的预防和治疗提供靶点。3.1研究背景激肽释放酶结合蛋白(Kallikrein-binding protein, KBP)是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员之一。KBP与激肽释放酶结合,抑制组织激肽释放酶的活性,抑制激肽的释放。KBP还具有降低血压,抑制血管增生,抑制炎症反应等多种生物学功能。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)能够诱发宿主产生炎症反应、释放炎症因子,导致败血性休克,LPS诱导的急性炎症模型成为研究炎症反应及抗炎药物的常用模型。本研究运用基因工程技术获得KBP重组蛋白,同时建立LPS诱导的败血症休克模型,研究KBP的抗炎作用和机制。3.2研究目标本研究主要探讨KBP下调LPS诱导炎症因子TNF-α表达的作用,明确KBP抑制LPS诱导的败血性休克作用,阐明KBP下调TNF-α的分子机制。3.3研究结果(1)KBP抑制LPS诱导的TNF-α转录和表达。运用基因工程方法获得KBP重组蛋白,荧光定量PCR方法和ELISA方法发现KBP明显抑制LPS诱导巨噬细胞TNF-α的转录和表达。(2)KBP提高LPS急性休克小鼠的生存率。腹腔注射LPS和KBP发现KBP显著下调血浆TNF-α水平,且KBP明显提高LPS诱导休克小鼠的生存率。(3)KBP上调SOCS3的转录和蛋白表达。荧光定量PCR方法和Western Blot技术证明KBP上调SOCS3的转录和表达,对SOCS1没有作用。(4)SOCS3介导KBP下调TNF-α的作用。siRNA介导的SOCS3基因沉默明显抑制KBP下调TNF-α的作用。(5)KBP不影响NF-(?)B亚基p65和β-catenin/TCF的转录活性。免疫荧光染色和荧光素酶报告基因技术证明KBP不影响NF-κB亚基p65的核转位和β-catenin/TCF的转录活性。3.4结论和意义KBP通过上调SOCS3的表达,抑制LPS诱导的TNF-α水平,发挥抗炎作用。本研究阐明KBP抗炎作用和分子机制,为急性炎症反应的预防和治疗提供线索。