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糖尿病是威胁人类健康的重要疾病,而胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗是导致2型糖尿病发生的主要原因。有关研究发现胰岛素受体后信号转导通路的缺陷与2型糖尿病相关,其中PTP1B作为负调控胰岛素通路的重要磷酸酯酶而受到广泛关注。降低PTP1B的活性可以增强胰岛素敏感性,从而改善2型糖尿病症状。本博士论文工作利用RNA干扰技术降低PTP1B基因的表达,并且观察到胰岛素信号传导的上调以及糖尿病小鼠症状的改善,为RNA干扰技术应用于糖尿病治疗提供了初步的证据。 第一部分工作利用能够在真核细胞中转录发卡结构小RNA的载体pSliencer,针对PTP1B表达框中的5个特定序列,构建了5个质粒(pS-MP1～5);同时将PTP1B的表达框插入绿色荧光蛋白(EGFP)表达框的5’端,构建了能够表达PTP1B-EGFP融和蛋白的载体作为报告质粒,将这两种质粒同时转染小鼠肝癌细胞Hepa 1-6,以荧光强度作为PTP1B表达量的间接反映,用流式细胞仪测量了不同序列的siRNA对PTP1B基因表达的下调效率,分别为:65%,72%,55%,57%和56%;并利用PTP1B的多克隆抗体对融合蛋白进行免疫印迹分析,确认了沉默效率最高的2号序列。以此为依据,合成了相应的siRNA。同时构建了在大肠杆菌中表达小鼠PTP1B基因dsRNA的载体,大量表达后用CF11亲合纯化dsRNA,经大肠杆菌RNase Ⅲ酶切,分子筛分离得到了esiRNA。esiRNA和合成的siRNA对PTP1B-EGFP融合蛋白表达的下调效率分别为94%和90%。 第二部分工作构建了一套对胰岛素信号响应的报告系统,由受胰岛素正调控的脂肪酸合成酶启动子和分泌型的乙肝病毒表面抗原组成,通过检测乙肝病毒表面抗原的表达来监测胰岛素信号通路的变化,具有简便快捷的优点。在小鼠体内,利用这套报告系统,采用了液压法注射,检测了esiRNA,合成的siRNA以及pS-MP2对胰岛素通路的影响。同时,为了进一步验证PTP1B的siRNA用于治疗糖尿病的可能性,利用四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠模型,检查了注射esiMP后小鼠血糖的变化。动物水平的实验表明PTP1B的siRNA具有上调胰岛素信号和改善糖尿病症状的作用。 第三部分工作用RT-PCR检测了PTP1B基因表达降低之后小鼠肝细胞中其它磷酸酯酶基因的表达情况,发现了TCPTP基因的表达有明显的上调,而LAR,SHP2基因的表达则没有明显变化。为了进一步研究TCPTP对胰岛素通路以及在2型糖尿病中的作用,大量表达了TCPTP dsRNA并且酶切纯化了针对TCPTP的siRNA:esiTP,利用TCPTP-EGFP融合蛋白检测了esiTP下调TCPTP基因表达的