【摘 要】
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目的:研究过表达成骨细胞胰岛素受体对成骨细胞分化及骨钙素表达的影响,进一步探讨成骨细胞分泌的骨钙素能否改善脂毒性引起的Beta-TC-6细胞胰岛素分泌障碍及其可能的机制。方法:1.实验设计:本研究的重点是“骨钙素—胰岛素环路”,选用的细胞为小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1和小鼠胰岛素瘤细胞Beta-TC-6。实验分为两部分,第一部分研究过表达MC3T3-E1细胞Ins R基因,探讨其对糖脂毒性成骨
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目的:研究过表达成骨细胞胰岛素受体对成骨细胞分化及骨钙素表达的影响,进一步探讨成骨细胞分泌的骨钙素能否改善脂毒性引起的Beta-TC-6细胞胰岛素分泌障碍及其可能的机制。方法:1.实验设计:本研究的重点是“骨钙素—胰岛素环路”,选用的细胞为小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1和小鼠胰岛素瘤细胞Beta-TC-6。实验分为两部分,第一部分研究过表达MC3T3-E1细胞Ins R基因,探讨其对糖脂毒性成骨分化障碍的影响。第二部分研究成骨细胞分泌的骨钙素以及外源性骨钙素能否促进Beta-TC-6细胞胰岛素的合成与释放,改善β细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）功能,并进行机制探讨。2.应用慢病毒质粒转染方法过表达MC3T3-E1细胞胰岛素受体（Ins R）基因,探讨其对糖脂毒性成骨细胞分化障碍及骨钙素表达的影响;进一步收集分化后的条件培养基干预Beta-TC-6细胞,Western blot、q PCR检测Beta-TC-6细胞骨钙素受体（Gprc6a）、GSIS相关葡萄糖转运体（Glut2）、胰岛素的变化趋势,探讨其能否改善胰岛素分泌功能。3.用外源骨钙素和高脂干预胰岛Beta-TC-6细胞,Western blot检测Gprc6a、Glut2以及PI3K/AKT/Fox O1/Pdx1信号通路的变化趋势,GSIS试验检测β细胞胰岛素的分泌量,q PCR检测Gprc6a、Glut2、胰岛素m RNA的改变,流式细胞术检测β细胞的凋亡情况;进一步使用PI3K抑制剂,观察是否可阻断骨钙素的上述效应。4.应用慢病毒质粒转染方法敲低胰岛Beta-TC-6细胞Gprc6a基因,并使用Fox O1抑制剂、Pdx1激活剂分别干预PI3K/AKT/Fox O1/Pdx1通路的关键分子,探讨骨钙素促进胰岛素分泌的相关机制。结果:1.诱导分化14天成骨细胞骨钙素与Runx2蛋白合成分泌量达高峰（P<0.05）,矿化结节较多,证明本实验最适诱导时间为14天。2.与对照组相比,高糖高脂干预可明显降低Runx2和骨钙素水平（P<0.05）,矿化结节减少,证明糖脂毒性可抑制成骨分化。3.过表达成骨细胞的Ins R基因可增加Runx2、骨钙素的表达（P<0.05）,促进成骨细胞分化,改善高糖高脂导致的成骨细胞分化障碍（P<0.05）。4.使用过表达Ins R的成骨细胞条件培养基干预,可上调β细胞膜Glut2、Gprc6a的表达,增加Beta-TC-6细胞胰岛素m RNA水平,并改善脂毒性引起的Beta-TC-6细胞Glut2、胰岛素的下调,且上述作用可被骨钙素中和抗体抑制（P<0.05）。5.Western blot及q PCR结果显示,外源羧化不全骨钙素可显著增加Beta-TC-6细胞Gprc6a的表达,并激活PI3K/AKT/Fox O1/Pdx1信号通路,增加pAKT/t-AKT、p-Fox O1/t-Fox O1的比例,上调Pdx1、胰岛素、Glut2的表达（P<0.05）;GSIS结果显示高糖环境下骨钙素刺激β细胞胰岛素分泌增加（P<0.05）;流式细胞术结果显示骨钙素可改善脂毒性引起的Beta-TC-6细胞凋亡（P<0.05）。加入PI3K抑制剂后,p-AKT/t-AKT、p-Foxo1/t-FOXO1比例降低,Pdx1、Glut2表达降低（P<0.05）,表明阻断PI3K可抑制骨钙素对脂毒性胰岛素分泌障碍的保护作用。6.敲减Beta-TC-6细胞的Gprc6a基因,可阻断骨钙素上调Glut2、胰岛素表达的效应（P<0.05）,分别加入Pdx1激动剂与Fox O1抑制剂,可部分抵消Gprc6a敲减引起的Glut2下调及胰岛素分泌障碍（P<0.05）,表明Gprc6a与Fox O1、Pdx1为上下游的关系。结论:1.激活成骨细胞胰岛素信号通路可改善糖脂毒性引起的成骨分化障碍,增加骨钙素的表达。2.骨钙素干预可通过激活β细胞Gprc6a/PI3K/AKT/Fox O1/Pdx1信号通路,上调Glut2的表达水平,改善脂毒性引起的胰岛素合成与分泌障碍。3.骨钙素和胰岛素可能形成内分泌环,相互促进,相互串扰。
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