小鼠牙胚早期的启动,定位以及形态发育的过程受上皮-间充质信号的调控,这当中所涉及的信号分子包括FGF,hedgehog(Hh),Wnt和BMP四大家族。而Bmp4作为BMP信号通路的一员,是哺乳动物牙胚中第一个表达的信号分子,在牙齿发生位置,发育类型的确定中发挥决定性作用。本实验室前期构建了颅神经嵴细胞中过表达Bmp4的小鼠:Wnt1-cre;pMes-Bmp4,其上下颌连接处形成一个背向舌侧生长的磨牙牙胚。该融合牙胚只有一小部分能够正常生长发育,大部分会发生退化。本研究利用该遗传修饰小鼠牙齿所具有的独特表型,探究融合牙胚产生的原因,并进一步分析了小鼠上下颌磨牙的分离机制,从基因功能获得角度探讨Bmp4基因对小鼠牙齿发育的调控作用。首先,我们利用整体原位杂交检测了Fgf8,Pax9和Pitx2在E9.0,E9.25,E9.5,E9.75,E10.0,和E10.5各时期野生型小鼠第一腮弓中的表达模式。结果发现,野生型小鼠中,Fgf8在E9.0限制在第一腮弓口腔面牙区上皮表达,可作为磨牙发生的起始位点。随第一腮弓的迁移发育,Ffg8的表达部位也逐渐延伸并一分为二。至E10.5,上颌突和下颌突口腔面牙区上皮各有一处Fgf8集中表达的部位。Pax9从E9.75开始在上颌突口腔面牙区间充质微弱表达,E10.0时在下颌突也有表达,至E10.5,Pax9在下颌突的表达部位朝身体远端进一步延伸。而Pitx2从E9.0—E10.5在第一腮弓口腔面的外胚层都有表达。进一步进行这几个时期的第一腮弓体内培养实验,发现E9.5之前,第一腮弓移植块绝大部分只有一个磨牙牙胚,而E9.5之后的第一腮弓移植块含两个磨牙牙胚。以上结果共同表明,小鼠上颌-下颌磨牙是由第一腮弓中的同一个牙胚发育而来,上下颌磨牙在定位时期经历了一个“一分为二”的过程。由于颅神经嵴细胞中Bmp4活性上调会造成牙胚融合,为探究Bmp4活性上调对早期磨牙牙胚定位的影响,我们同样利用整体原位杂交的方法检测了Fgf8,Pax 和Pitx2在E9.0-E10.5阶段的Wnt1-cre;pMes-Bmp4小鼠第一腮弓中的表达模式。发现突变型小鼠中,Fgf8在第一腮弓口腔面牙区上皮始终只有一处表达的部位,不发生分裂,至E 10.5,其表达区域集中在上下颌突连接处。而且该时期突变型小鼠只形成了极小的上颌突。此外,Pax9在E9.75的表达位置与野生型小鼠相同,但E10.0,其在下颌突没有表达,至E10.5,Pax9表达区域延伸至上下颌突连接处周围。而Pitx2从E9.0—E10.5在第一腮弓口腔面的外胚层都有表达。接着进行第一腮弓体内培养实验,发现移植块大多不长牙,小部分只含一个磨牙牙胚。以上结果都说明,颅神经嵴细胞过表达Bmp4后影响了小鼠早期第一腮弓的正常发育,并造成原先的一个磨牙牙胚位点不发生分裂,牙胚异常定位于上下颌连接处。进一步从细胞和分子水平探究Bmp4基因调控小鼠上下颌磨牙分离的机制,结果发现Wnt1-cre;pMes-Bmp4小鼠早期第一腮弓细胞增殖与凋亡水平无异常,而早期第一腮弓Bmp4/P38信号明显上调。说明P38信号通路表达水平提高使BMP稳态被破坏,导致小鼠早期第一腮弓发育及上颌-下颌磨牙模式化的异常。此外,我们还进一步检查双转基因小鼠两种牙胚表型即融合牙胚与退化牙胚组织中BMP信号胞内信号转导途径—BMP/Smad4,P38,Erk1/2和JNK的表达水平,结果显示,突变型小鼠牙胚组织中同样只有Bmp4/P38信号活性显著上调,而且退化牙胚pSmad1/5/8的表达水平有明显降低。说明BMP/Smad4信号可能与融合牙胚发育后期出现退化有一定联系。用P38信号通路小分子抑制剂SB203580进行挽救实验,发现突变型小鼠腭裂及上下颌磨牙分离异常等异常表型可被部分挽救。综上所述,本研究阐明了小鼠上下颌磨牙一分为二的分离方式,说明了BMP4/P38信号对小鼠上下颌磨牙模式化及牙齿发育的重要性。该实验结果进一步完善了小鼠牙齿发育的分子机制,有助于加深人们对哺乳动物牙胚发育模式和机理的理解。