研究背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一。在中国,因HCC导致的死亡人数在所有恶性肿瘤中位居第二位,仅次于肺癌。目前临床上针对HCC的最佳治疗方案是根治性手术,但是由于HCC具有恶性程度高、疾病进展迅速等特点,因此很多病例在发现时已经失去了手术的机会。即使能够手术治疗,术后的复发率和转移率也非常高。这种情况下,包括化疗、靶向治疗等综合性治疗方式就成为了不可替代的关键环节。但是由于HCC对大部分的化疗药物不敏感,导致HCC的化疗效果不佳。索拉非尼（Sorafenib）是一种酪氨酸激酶抑制剂,它是目前治疗无法切除或远处转移的HCC的一线用药,具有抑制肿瘤细胞增殖和抗血管生成的作用,但是这种作用可能会因为耐药性的出现而丧失。目前我们对于HCC的病因和耐药性出现的机制尚不完全清楚,因此需要更加深入地了解HCC的发生、发展以及耐药性背后的遗传学和表观遗传学机制,以制定更加有效的治疗干预策略。在本研究中,我们发现在基于索拉非尼治疗的患者源性异种移植瘤（Patient derived tumor xenograft,PDX）模型中DUXAP8显著上调,而这通常预示着患者预后较差。在HCC中,DUXAP8通过增加m6A甲基化介导的RNA稳定性来维持其表达量的上调。在体内和体外,DUXAP8的水平与HCC增殖、干细胞特征维持和索拉非尼耐药呈正相关。在机制研究中我们发现DUXAP8是通过ce RNA机制竞争性地结合mi R-584-5p,从而作为mi R-584-5p的分子海绵来调控MAPK1的表达,进而激活MAPK/ERK通路。我们的研究发现可以为HCC患者找到新的预后指标和治疗靶点提供思路。方法:（1）构建索拉非尼治疗的患者源性异种种植（PDX）模型,应用Lnc RNA-seq鉴定用生理盐水或索拉非尼处理的P4-PDX之间差异表达的Lnc RNA。（2）通过RT-q PCR验证HCC组织及肿瘤旁正常组织中DUXAP8的表达情况,并将DUXAP8的表达情况与临床病理参数进行相关性分析,探究DUXAP8表达量与患者预后的关系。（3）通过RT-q PCR验证DUXAP8在七株肝癌细胞系（MHCC-97H,Huh7,HCCLM3,Bel-7405,SNU-449,SK-Hep-1,SNU-182）和人肝永生化细胞系（THLE-3）中的表达情况,筛选出实验用肝癌细胞系。（4）构建DUXAP8低表达和过表达的HCC细胞模型,通过成球试验、Western Blot、RT-q PCR探究DUXAP8对HCC细胞干细胞特征的影响;通过集落形成实验、CCK-8检测探究DUXAP8在HCC细胞增殖和对索拉非尼耐药中的作用。（5）构建DUXAP8正常表达和低表达的裸鼠移植瘤模型和肺转移模型,通过检测皮下移植瘤大小和生长曲线、免疫组织化学技术探究DUXAP8在HCC细胞增殖和对索拉非尼耐药中的作用。（6）通过甲基化RNA免疫沉淀q PCR（Me RIP-q PCR）检测HCC细胞和人正常肝细胞中DUXAP8的m6A富集程度,应用TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库和GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）数据库分析甲基转移酶样蛋白3（Mettl3）在正常肝组织与HCC组织中的表达差异及其与DUXAP8之间的相关性;构建Mettl3低表达和过表达的HCC细胞模型,通过RT-q PCR、Me RIP-q PCR检测DUXAP8的表达情况和m6A富集程度;通过放射菌素D实验探究Mettl3对DUXAP8稳定性的影响。（7）通过RT-q PCR检测DUXAP8在HCC细胞中的定位,对沉默DUXAP8的HCC细胞进行micro RNA-seq,筛选出差异表达的micro RNA;结合生物信息学数据库Encyclopedia of RNA Interactomes（ENCORI,previously known as star Base v2.0）,预测能够与DUXAP8靶向结合的micro RNA;通过双荧光素酶报告基因（Luciferase assay）、RNA免疫共沉淀（RIP）、RNA下拉实验（RNA pull-down）探究DUXAP8与mi R-584-5p的关系。（8）通过成球试验、Western Blot、RT-q PCR、CCK-8检测探究DUXAP8、mi R-584-5p在HCC细胞干细胞特征维持、增殖和对索拉非尼耐药中的作用。（9）对沉默DUXAP8的HCC细胞进行RNA-seq,筛选靶基因并对DUXAP8调控表达的差异基因进行KEGG富集分析;通过双荧光素酶报告基因、Western Blot、RT-q PCR验证mi R-584-5p与MAPK1的关系。（10）通过成球试验、Western Blot、RT-q PCR、CCK-8检测探究DUXAP8、MAPK1在HCC细胞干细胞特征维持、增殖和对索拉非尼耐药中的作用;通过Western Blot进行机制分析。结果:（1）DUXAP8在用生理盐水或索拉非尼处理的P4-PDX之间差异表达的Lnc RNA中上调明显;与肿瘤旁正常组织相比,DUXAP8在HCC组织中显著高表达;高表达的DUXAP8与肿瘤TNM分期、肿瘤大小、微血管侵犯以及远处转移相关,并且DUXAP8高表达的HCC患者往往预后较差。（2）DUXAP8在七株肝癌细胞系（MHCC-97H,Huh7,HCC-LM3,Bel-7405,SNU-449,SK-Hep-1,SNU-182）中的表达量明显高于其在人肝永生化细胞系（THLE-3）中的表达量;在七株肝癌细胞系中,DUXAP8在Huh7和SNU-449细胞系中表达量相对较高,在SK-Hep-1和HCC-LM3细胞系中表达量相对较低。（3）体外实验证实DUXAP8沉默后降低了HCC细胞的干细胞特征,抑制了HCC细胞的增殖能力,增强了HCC细胞对索拉非尼的敏感性;DUXAP8的过表达则促进了HCC细胞的干细胞特征和增殖能力,同时促进了HCC细胞对索拉非尼的耐药;体内实验证实DUXAP8沉默后,抑制了HCC细胞的增殖能力,增强了HCC细胞对索拉非尼的敏感性,并且抑制了HCC细胞的肺转移能力。（4）Me RIP-q PCR结果显示:HCC细胞系中DUXAP8的m6A富集程度明显高于正常肝细胞系;通过检索TCGA数据库和GEPIA数据库,发现HCC组织中Mettl3的表达水平明显高于对应的正常肝组织,并且Mettl3和DUXAP8的表达水平之间存在显著正相关;在沉默Mettl3的HCC细胞中,DUXAP8的表达水平显著降低,DUXAP8的m6A富集程度也出现了下降,同时降低了DUXAP8的稳定性;在过表达Mettl3的HCC细胞中,DUXAP8的表达水平相应升高,DUXAP8的m6A富集程度也出现了升高,同时增加了DUXAP8的稳定性。（5）DUXAP8在HCC细胞中的定位主要在细胞质,mi R-584-5p为micro RNAseq结合生物信息学数据库Encyclopedia of RNA Interactomes（ENCORI,previously known as star Base v2.0）筛选的能够与DUXAP8靶向结合的micro RNA,通过RTq PCR、双荧光素酶报告基因、RNA免疫共沉淀、RNA下拉实验证实mi R-584-5p为DUXAP8靶向结合的micro RNA;RNA干扰技术和共转染技术证实mi R-584-5p能够逆转DUXAP8沉默/过表达在HCC细胞干细胞特征维持以及对索拉非尼耐药中的作用。（6）MAPK1是对DUXAP8沉默的HCC细胞进行RNA-seq筛选出的靶基因,MAPK/ERK通路是KEGG富集分析的最主要的相关信号传导通路;通过RTq PCR、双荧光素酶报告基因证实mi R-584-5p在HCC细胞中能够直接靶向MAPK1,RNA干扰技术和共转染技术证实MAPK1能够逆转mi R-584-5p沉默/过表达在HCC细胞干细胞特征维持以及对索拉非尼耐药中的作用。（7）Western Blot结果显示,DUXAP8沉默可以抑制ERK/CREB的磷酸化水平,但是对JNK/p-38的磷酸化水平没有影响,而过表达MAPK1可以消除DUXAP8沉默对ERK/CREB磷酸化水平的抑制作用;过表达DUXAP8可以促进ERK/CREB的磷酸化水平,沉默MAPK1可以消除过表达DUXAP8对ERK/CREB磷酸化水平的促进作用。结论:（1）DUXAP8在HCC组织中高表达,并且与HCC的恶性程度呈正相关;DUXAP8的过表达促进了HCC细胞的干细胞特征和增殖,并且促进了HCC细胞对索拉非尼的耐药。（2）Mettl3介导的m6A修饰在维持DUXAP8在HCC细胞中的高表达以及稳定性方面发挥着重要的作用。（3）DUXAP8是通过ce RNA机制竞争性地结合mi R-584-5p,从而靶向MAPK1,激活MAPK/ERK通路来调控HCC的恶性表型及对索拉非尼的耐药。