【摘 要】
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目的:马属动物早期妊娠诊断方法的不断更新,是马属动物养殖业的发展基础,早期妊娠诊断方法的更新不但能够增加经济收入,而且能给怀孕的动物更好的营养补充和有效保护,增加生产效率,减少意外流产。本研究旨在建立马属动物早期妊娠的快速诊断技术。方法:1.用双抗夹心法,建立孕马血清促性腺激素（PMSG）的酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测试剂盒;2.使用柠檬酸还原法和4-（2-羟乙基）-1-哌嗪基乙磺酸（HE
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目的:马属动物早期妊娠诊断方法的不断更新,是马属动物养殖业的发展基础,早期妊娠诊断方法的更新不但能够增加经济收入,而且能给怀孕的动物更好的营养补充和有效保护,增加生产效率,减少意外流产。本研究旨在建立马属动物早期妊娠的快速诊断技术。方法:1.用双抗夹心法,建立孕马血清促性腺激素（PMSG）的酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测试剂盒;2.使用柠檬酸还原法和4-（2-羟乙基）-1-哌嗪基乙磺酸（HEPES）一步法制备不同颜色和形状的金纳米粒子并使用双抗夹心法的原理,建立PMSG的侧流免疫层析技术。结果:1.根据ELISA双抗夹心法检测PMSG,结果表明最佳的反应条件如下:单抗包被的最佳工作浓度为8.5μg/m L;酶标抗体最佳工作浓度为3.5μg/m L;最佳包被稀释液为CB;最佳封闭时间为4小时;最佳抗原反应时间为60分钟;最佳标记单抗反应时间为60分钟;最佳底物作用时间为10分钟。2.所建立的ELISA双抗夹心法特异性良好;灵敏度为25 IU/m L;重复性良好;将50 IU/m L确定为妊娠与未妊娠的临界值。3.建立了PMSG侧流免疫层析技术:使用双抗夹心法,制备PMSG的侧流免疫层析试纸条,其优化结果为:（1）选用柠檬酸三钠作为还原剂和稳定剂制备金纳米粒子,得到颜色透亮,没有沉淀的酒红色胶体,在520 nm处出现表面等离子体共振峰,峰型窄,半峰宽约为30 nm,粒径大小约为20 nm的球状金纳米粒子。经过实验对比,确定花状金纳米粒子的制备方法为一步法,用HEPES常温还原氯金酸,得到的金纳米粒子溶液呈现透亮的海蓝色,颜色均一,无分层现象、无漂浮物和沉淀出现,在594 nm处出现表面等离子体共振峰,峰型较窄,半峰宽约为80 nm,平均粒径为50±5 nm的花状金纳米粒子。（2）金纳米粒子标记抗体的最适稳定量为1 m L金纳米粒子溶液中加入4.8μL标记抗体9F6;金纳米粒子标记抗体最佳p H值为8.0;GF60-S型号的玻璃纤维膜为最佳样品垫材料;含有10%BSA、1%吐温-20、10%蔗糖的0.02 M Tris-HCl缓冲液处理的样品垫效果最好;33Glass型号的玻璃纤维膜为最佳结合垫材料;结合垫添加5μL封闭剂效果最佳;Millipore 180型号的NC膜最适合;T线包被抗PMSG的单克隆抗体1H9的最佳条件为单抗:包被稀释液=8:2。4.建立的PMSG侧流免疫层析试纸条的特异性良好;红色试纸条灵敏度为50IU/m L,蓝色试纸条灵敏度为25 IU/m L;重复性、稳定性均良好。结论:1.本实验优化反应条件,建立了检测PMSG的ELISA双抗夹心法,该方法特异性强、重复性良好、灵敏度高;2.用柠檬酸三钠还原法制备的酒红色球状金纳米粒子溶液,颗粒大小均一,稳定性良好,单分散性强;用HEPES一步法制备的蓝色花状金纳米粒子溶液,颗粒大小均一,稳定性、分散性较好。3.本实验制备了两种不同颜色的PMSG侧流免疫层析试纸条,红色和蓝色的试纸条特异性都较好,但蓝色试纸条灵敏度高于红色的。本实验通过侧流免疫层析技术,建立了PMSG的检测方法,为进行简单、便捷、高灵敏度、成本低的马属动物早期妊娠妊娠检测奠定了理论基础。
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