新城疫病毒(NDV)是副黏病毒科副黏病毒亚科禽病毒属的成员,是有囊膜的负链RNA病毒,可引起禽类的新城疫。我国经过多年的综合防制,现已基本控制了该病的流行。近年来,我国新城疫的发生出现新的特点,即非典型新城疫病例日益增多,高抗体鸡群出现发病等。许多学者认为这可能与NDV毒株变异有关。开展NDV的病原研究和新型疫苗的开发显的尤为重要。本研究对6株NDV分离株的F、HN基因的遗传变异进行研究,目的是从分子水平上了解我国NDV流行毒株与疫苗毒株的分子差异,探索新城疫疫苗免疫失败的原因;采用生物信息学工具对NDV分离株的F蛋白的结构与参考毒株进行了比较分析,目的为在核苷酸和氨基酸水平解释NDV分离株生物学特性的变异提供依据;克隆了NDV-F基因和鸡的IL-2基因,构建了鸡新城疫核酸疫苗质粒,旨在为预防NDV感染的辅助免疫提供理论基础和技术支持。研究内容如下:1.应用RT-PCR方法对6个NDV分离株(ZD、JZ、XB、CA、ZZ、CC)的F基因主要功能区片段进行了扩增,各扩增产物经克隆、测序后与GenBank登录的NDV参考毒株的F基因进行核苷酸及推导氨基酸序列分析。结果表明,6个NDV分离毒株间的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸同源性分别在99.6%~99.9%和99.1%~99.8%之间;分离毒株与参考毒株F基因核苷酸和F蛋白氨基酸序列同源性分别在83.2%~87.3%和90.2%~93.8%之间;F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株的分子特征;其F基因的分子特性显示6个分离株均属基因Ⅶ型。研究结果提示,6个NDV分离株可能是同一毒株在传播过程中发生的不同变异株。NDV分离株与临床常用疫苗株的F基因同源性较低,在遗传进化上亲缘关系较远,这可能是疫苗免疫鸡群发病的重要原因之一。2.应用RT-PCR方法对6个NDV分离株的HN基因进行了扩增,各扩增产物经克隆、测序后与GenBank登录的NDV参考毒株的HN基因进行了核苷酸及推导氨基酸序列分析。结果表明,6个NDV分离毒株间的HN基因核苷酸和HN蛋白氨基酸同源性分别在98.7%~99.8%和98.1%~99.7%之间;分离毒株与参考毒株HN基因核苷酸HN蛋白氨基酸序列同源性分别在78.22%~85.3%和82.6%~90.0%之间;6个NDV分离株的HN蛋白均属于HN571亚型,分离株与常用疫苗株的HN基因同源性较低。5个NDV分离株中的HN蛋白在538~540aa缺失潜在糖基化位点。3.对NDV分离株ZD的F基因进行了序列测定,对其推导氨基酸序列与GenBank登录的NDV参考毒株的F蛋白序列进行了结构分析。ZD株的F基因的开放阅读框架编码553个氨基酸的F蛋白。二级结构分析后发现,ZD株的F蛋白的α螺旋中心、β-折叠、转角和无规则卷曲的分布与JS-2-06株最为接近,与常规疫苗株La Sota、Clone-30、B1和V4等毒株相比,在124-167aa的α螺旋中心分为两段,在377-386aa少一个β-折叠区域。对蛋白B细胞抗原表位、跨膜结构分析后发现,ZD株B细胞抗原表位4个参数共同区的分布与F48E9、Mukteswar和JS-2-06相似。而比La Sota、Clone-30、B1和V4株在110-117aa区段多一个共同区域。利用生物学软件对ZD株F0蛋白的三维空间结构进行了预测。这为在核苷酸和氨基酸水平解释NDV分离株生物学特性的变异提供了研究线索。4.将NDV分离株的F基因成功地插入到pcDNA4/HisMax,构建了新城疫核酸疫苗质粒pcDNA4-F;将NDV的F基因和鸡IL-2基因串联插入pcDNA4/HisMax,构建了新城疫核酸疫苗质粒pcDNA4-F+IL-2,并进行了鸡的免疫试验。试验显示,构建的新城疫核酸疫苗质粒对NDV感染有一定的保护作用。这为新城疫的核酸疫苗研究提供了有用的资料。