目的脑老化是随着年龄的增加人脑出现的一系列功能和结构形态的退行性变化。脑老化的过程中,脑细胞表现为生物能量受损、神经元网络异常、氧化修饰的细胞器和分析出现炎症聚集等现象[1],会进一步导致痴呆、帕金森和脑血管疾病等神经退行性疾病的发生和发展,我国先已步入老龄化社会,因衰老引发的各种神经性疾病导致的死亡人数逐年增加。因此,寻找减少和缓解老年性脑病和脑老化进程的有效方法尤为重要。人脑中神经元细胞比例仅约10%,胶质细胞占脑细胞绝大部分,主要辅助神经元参与其保护、支持、营养及调节等作用。脑胶质细胞的普遍衰老会导致脑老化进程加快,神经稳态与调节相关基因表达改变,严重将导致神经元损伤,神经退行性疾病的发生及大脑认知能力下降,抗脑胶质细胞衰老对抗脑老化进程具有重要意义。黄连与肉苁蓉作为传统医学临床用药,其配伍应用常见于各类方剂中。黄连又名“鸡爪连”“味连”等,为毛茛科多年生草本植物。其生物碱类、黄酮类、木脂素类等化学成分含量丰富。小檗碱（Berberine,Ber）是黄连生物碱中最具代表性也是含量最高的活性物质之一,现代药理研究发现小檗碱保护心血管系统、抗肿瘤、抗炎和抗菌等作用[2];肉苁蓉又名“寸芸”“苁蓉”等,属列当科唇形目植物。肉苁蓉含苯乙醇苷类、环烯醚萜及其苷类等多种化学成分,松果菊苷（Echinacoside,Ech）是肉苁蓉苯乙醇苷类中主要活性成分之一,现代药理研究发现其具有良好的抗衰老、抗氧化和神经保护等作用[3-5]。本实验借鉴中医临床经验,体内实验结合黄连与肉苁蓉作用于正常衰老小鼠,观察其对衰老小鼠海马体细胞形态的影响;体外实验结合Ber与Ech,作用于拓扑异构酶Ⅱ抑制剂依托泊苷（Etoposide,Eto）诱导衰老的神经胶质细胞HEB,探究其抗脑老化的作用分子机制,为传统中药及其单体抗脑老化的分子机制提供实验依据和理论基础。方法1.HE染色观察小檗碱联合肉苁蓉给药对衰老小鼠海马体细胞的影响;2.β-半乳糖苷酶染色法检测Eto对HEB细胞衰老造模的最适浓度;CCK8细胞增殖检测细胞活力检测不同浓度Ber及Ech对HEB细胞的毒性作用及筛选Ber及Ech对HEB细胞合适加药浓度;3.CCK8细胞增殖检测Ber联合Ech对Eto诱导的衰老HEB细胞活力的影响;4.β-半乳糖苷酶染色法检测Ber联合Ech对Eto诱导的衰老HEB细胞衰老状态的影响;5.流式细胞术检测Ber联合Ech对Eto诱导的衰老HEB细胞周期的影响;6.激光共聚焦观察Ber联合Ech对Eto诱导的衰老HEB细胞内ROS氧化应激水平及细胞核形态的影响。7.Western Blot检测Ber联合Ech对Eto诱导的衰老HEB细胞内FoxO1蛋白水平表达的影响及其调控的下游通路抗氧化蛋白Catalase、SOD2表达和抗凋亡蛋白Bcl-2表达的影响。结果1.黄连结合肉苁蓉对正常衰老小鼠海马体组织形态的影响HE染色结果显示,正常衰老小鼠海马体CA1和CA3区域多数细胞核膜溶解、核固缩、细胞形态改变、细胞分布松散且数量较少;给药组小鼠海马体CA1和CA3区域细胞形态正常,核膜明显且细胞核位于细胞中央,细胞数量较多;正常衰老组与给药组小鼠海马体CA2区域细胞形态均正常。2.Eto对HEB细胞衰老造模的最适浓度及Ber和Ech对HEB细胞合适加药浓度随着Eto浓度的增加,HEB细胞内β-半乳糖苷酶活性增加,染色逐渐加深,衰老阳性HEB细胞比例上升,最终选择10-4μM Eto为HEB细胞衰老造模浓度;CCK8细胞增殖检测在10-8-10-4μM浓度范围内的Ber及Ech对HEB细胞均无明显毒性作用（P＞0.05）,选择10-4μM的Ber及Ech作为单独加药浓度,5×10-5μM Ber+5×10-5 μM Ech作为联合加药浓度。3.Ber联合Ech对Eto诱导的衰老HEB细胞活力的影响CCK8细胞增殖检测结果显示,对比正常组,Eto造模处理24 h后HEB细胞活力显著下降（P＜0.05）;Eto造模后加药处理24 h,对比Eto造模组,Ber联合Ech及Ech单独加药组可有效恢复Eto诱导的HEB细胞活力下降趋势（P＜0.05）;Ber单独加药组与Eto造模组HEB细胞活力差异没有统计学意义（P＞0.05）。4.Ber联合Ech对Eto诱导的衰老HEB细胞衰老状态的影响β-半乳糖苷酶染色法染色结果显示,Eto造模24 h后衰老阳性细胞比例上升（P＜0.01）;Ber单独加药组、Ech单独加药组及Ber联合Ech组加药处理24h后均能有效降低Eto导致的衰老阳性HEB细胞比例（P＜0.01）。5.Ber联合Ech对Eto诱导的衰老HEB细胞周期的影响PI染色后流式细胞术结果显示,Eto造模24 h后多数HEB细胞周期阻滞于G2/M期;Ech单独加药组及Ber联合Ech组加药处理24 h后均能有效降低Eto阻滞的G2/M期HEB细胞比例（P＜0.05）,Ber单独加药组对Eto导致的HEB细胞G2/M期周期阻滞无明显作用（P＞0.05）。6.Ber联合Ech对Eto诱导的衰老HEB细胞内ROS氧化应激水平及细胞核形态的影响激光共聚焦荧光结果显示,对比正常组HEB细胞内ROS水平,Eto造模24 h后HEB细胞内ROS荧光强度显著增加,氧化应激水平显著上升;Ber单独加药组、Ech单独加药组及Ber联合Ech组加药处理24 h后均能显著抑制Eto导致的HEB细胞内ROS水平上升;Hoechst33342荧光染色结果显示,对比正常组,各组细胞核形态均无明显差异。7.Ber联合Ech对Eto诱导的衰老HEB细胞内FoxO1通路调控的抗凋亡及抗氧化蛋白表达的影响Western Blot蛋白条带灰度值分析结果显示:与Eto模型组相比,Ech单独加药组与Ber联合Ech加药组均显著促进了 FoxO1、Bcl-2、Catalase和SOD2的表达（P＜0.05）;Ber组能显著促进HEB细胞Foxo1,Catalase和Bcl-2的表达（P＜0.05）,但对SOD2的表达无明显作用（P＞0.05）。结论1.黄连联用肉苁蓉能有效抑制正常衰老小鼠海马体细胞形态改变及减少。2.Ber联合Ech显著增加Eto诱导的衰老HEB细胞活力和衰老阳性HEB细胞比例。3.Ber联合Ech显著减少Eto诱导阻滞于G2/M期的HEB细胞比例。4.Ber联合Ech显著降低了 Eto诱导的HEB细胞内ROS氧化应激水平。5.Ber联合Ech显著上调了 Eto诱导的HEB细胞内FoxO1通路调控的抗凋亡及抗氧化蛋白表达。