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类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性自身免疫性炎症性疾病。破骨细胞（Osteoclast,OC）介导的骨吸收功能亢进导致关节骨侵蚀和全身骨丢失是RA常见的病理特征,且为RA致残的重要病理进程。因此,通过调节OC分化和功能,抑制骨吸收,是治疗RA的有效手段。近年研究表明,骨组织微环境与免疫系统相互作用,形成骨免疫微环境,可影响RA骨代谢。其中,调节性T细胞（Regulatory Tcell,Treg）可通过与OC前体细胞表面的CD80/CD86结合或分泌抑制免疫活性的细胞因子如IL-10抑制OC分化。JAK2/STAT3信号通路广泛表达于包括OC与Treg在内的多种细胞,参与调节细胞生长发育、免疫应答等重要生物学过程。益肾蠲痹丸（Yi Shen Juan Bi Pill,YSJB）是基于补肾通络法治疗RA的经典复方,临床表明其可改善RA引起的骨质破坏。本课题组前期研究发现YSJB可显著减轻CIA大鼠关节骨侵蚀,抑制CIA大鼠关节炎症和OC分化。体外实验也表明,YSJB不仅能直接抑制OC分化和骨吸收,还能通过提高Treg免疫抑制功能,间接抑制OC分化和骨吸收,但其分子机制尚未明了。本研究基于JAK2/STAT3信号通路,通过建立OC单培养、Treg单培养、OC-Treg共培养三个培养体系,采用YSJB含药血清和JAK2/STAT3信号通路阻断剂AG490以及靶向JAK2的siRNA进行干预,以期阐明YSJB改善RA骨吸收的作用机制。本研究分为以下三部分:实验一基于JAK2/STAT3信号通路探讨益肾蠲痹丸抑制破骨细胞分化和骨吸收的作用目的:本研究基于OC单培养体系,采用AG490和JAK2 siRNA干预,观察YSJB对OC分化及骨吸收功能的影响,并探讨JAK2/STAT3信号通路在OC分化中的作用。方法:SD大鼠制备肾虚CIA模型2周后,通法灌服YSJB或甲氨蝶呤（Methotrexate,MTX）获取含药血清。从雄性C57BL/6小鼠的胫骨和股骨中分离小鼠骨髓单核细胞,然后加入刺激因子,将其诱导为OC前体细胞,再分别加入DMSO、AG490、转染试剂（MOCK）、JAK2 siRNA干预,24h后加入含10%各组血清（假手术血清、肾虚CIA血清、MTX含药血清、YSJB含药血清）的培养液。OC前体细胞诱导培养5天后,行抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP）染色观察OC分化情况;收集 OC 采用 qRT-PCR 检测 OC 中 JAK2、STAT3、RANK、NFATc1、c-fosmRNA 表达水平。将牛骨片置于OC前体细胞中培养10天后对骨片进行甲苯胺蓝染色,观察骨吸收陷窝面积的变化。结果:MTX和YSJB含药血清干预OC前体细胞后,与CIA血清组相比,TRAP+OC数目及骨吸收陷窝面积显著下降（P＜0.05;P＜0.01）。AG490和JAK2 siRNA干预后,与未干预组相比,TRAP+OC数目及骨吸收陷窝面积进一步减少（P＜0.05;P＜0.01）。与Control血清组相比,CIA血清组中RANK、NFATc1、c-fosmRNA水平显著上调（P＜0.05;P＜0.01）。与CIA血清组相比,MTX血清组、YSJB血清组中RANK,NFATc1,c-fos基因表达水平下调（P＜0.05;P＜0.01）。AG490干预OC前体细胞后,与未干预组相比,相应各组RANK,NFATc1,c-fos基因表达均下降（P＜0.05;P＜0.01）;JAK2 siRNA转染于OC前体细胞后,与未转染组相比,除CIA血清组中NFATc1外,其他各组RANK,NFATc1,c-fos基因表达均降低（P＜0.05;P＜0.01）。此外,JAK2 siRNA转染于OC前体细胞后,与未转染组相比,各组JAK2和STAT3基因表达均降低,除YSJB血清组中STAT3外,其他各组差异均有统计学意义（P＜0.05;P＜0.01）。在OC单独培养体系中,与Control血清组相比,CIA血清组JAK2,STAT3 mRNA表达水平显著增加（P＜0.05;P＜0.01）;而与CIA血清组相比,MTX血清组和YSJB血清组中JAK2和STAT3基因表达水平降低（P＜0.05;P＜0.01）。小结:YSJB可通过抑制OC单培养体系OC内JAK2/STAT3信号通路,下调OC中RNAK、c-fos与NFATc1表达,从而直接抑制OC分化和骨吸收。实验二基于JAK2/STAT3信号通路探讨益肾蠲痹丸促进调节性T细胞功能的作用目的:本研究基于Treg单培养体系,采用AG490和JAK2 siRNA干预,探讨YSJB对Treg免疫抑制功能的影响及作用机制。方法:采用雄性C57BL/6小鼠脾细胞分选CD4+CD25+Treg细胞,诱导成功的Treg接种于圆底96孔板内,分别加入DMSO、AG490、MOCK、JAK2 siRNA干预24h,然后加入含10%各组血清（假手术血清、肾虚CIA血清、MTX含药血清、YSJB含药血清）的培养液。细胞培养5天后,收集Treg,应用qRT-PCR检测Treg中JAK2、STAT3、IL-10、TGF-β1 mRNA表达水平;收集细胞培养上清,应用ELISA法检测IL-10、TGF-β1蛋白水平。结果:在Treg单培养体系中,与Control血清组相比,CIA血清组IL-10基因及蛋白表达水平显著降低（P＜0.05;P＜0.01）;与CIA血清组相比,MTX血清组、YSJB血清组中IL-10基因和蛋白表达水平呈现不同程度回调（P＜0.05;P＜0.01）。AG490或JAK2 siRNA干预Treg后,与未干预组相比,相应各组IL-10基因和蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05;P＜0.01）。而TGF-β1表达水平变化均无统计学差异。通过OC选用的JAK2 siRNA序列对敲低Treg中JAK2基因表达水平有效,JAK2 siRNA干预Treg后,与未转染组相比,各组JAK2和STAT3基因表达均显著降低（P＜0.01）。与Control血清组相比,CIA血清组JAK2与STAT3 mRNA表达水平增加（P＜0.05;P＜0.01）;与相应CIA血清组相比,MTX血清组、YSJB血清组中二者基因表达水平下降（P＜0.05;P＜0.01）。小结:YSJB可通过抑制Treg单培养体系Treg中JAK2/STAT3信号通路,促进Treg分泌IL-10,从而增强Treg的免疫抑制功能。实验三基于JAK2/STAT3信号通路探讨益肾蠲痹丸抑制OC-Treg共培养体系中破骨细胞分化和骨吸收的作用目的:本实验基于OC-Treg共培养体系,采用AG490和JAK2 siRNA干预,探讨YSJB对OC-Treg共培养体系中OC分化及骨吸收功能的影响和潜在机制。方法:按实验一方法分离小鼠骨髓细胞并诱导为OC前体细胞,按实验二方法从小鼠脾脏分选并扩增Treg。将Treg与OC前体细胞以1:25的比例进行共培养,再分别加入DMSO、AG490、MOCK、JAK2 siRNA。24 h后加入各组含药血清（假手术血清、肾虚CIA血清、MTX含药血清、YSJB含药血清）继续培养。OC-Treg共培养5天后,行TRAP染色观察OC分化情况;收集OC总RNA,应用qRT-PCR法检测细胞中RANK、NFATc1、c-fos mRNA表达水平;将牛骨片置于OC-Treg共培养体系中培养10天后对骨片进行甲苯胺蓝染色,观察骨吸收陷窝面积。结果:在OC-Treg共培养体系中,与Control血清组相比,CIA血清组TRAP+OC数目及骨吸收陷窝面积增多（P＜0.05;P＜0.01）;与CIA血清组相比,MTX血清组和YSJB血清组中TRAP+OC数目及骨吸收陷窝减少,除YSJB血清组中骨吸收陷窝面积外,其他各组差异均有统计学意义（P＜0.05;P＜0.01）。AG490或JAK2 siRNA干预共培养细胞后,与未干预组相比,TRAP+OC数目及骨吸收陷窝面积均降低。但是AG490或JAK2 siRNA与YSJB合用不能增强YSJB的抑制作用。且无论有无AG490或JAK2 siRNA干预,OC+Treg共培养组TRAP+OC数目及骨吸收陷窝面积均比OC单独培养时低（P＜0.05;P＜0.01）。此外,在OC+Treg共培养体系中,与Control血清组相比,CIA血清组RANK,NFATc1,c-fos mRNA表达水平增加（P＜0.05;P＜0.01）;与相应CIA血清组相比,MTX血清组、YSJB血清组中RANK,NFATc1,c-fos基因表达水平下降（P＜0.05;P＜0.01）。AG490干预共培养细胞后,与未干预组相比,相应各组RANK,NFATc1,c-fos基因表达均降低（P＜0.05;P＜0.01）;JAK2 siRNA转染于共培养细胞后,除Control血清组中c-fos,其他相应各组RANK,NFATc1,c-fos基因表达降低（P＜0.05;P＜0.01）。小结:Treg抑制OC分化和骨吸收;YSJB下调OC-Treg共培养体系中RNAK、c-fos、NFATc1基因表达,抑制OC分化和骨吸收,该作用与JAK2/STAT3信号通路相关。结论:YSJB可直接调节OC中JAK2/STAT3信号通路,从而下调OC中RANK、NFATc1、c-fos基因表达,抑制OC分化及骨吸收功能。此外,YSJB还可调节Treg中JAK2/STAT3信号通路,上调IL-10表达,增强Treg免疫抑制功能,间接抑制OC分化和骨吸收功能。