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目的肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae, S.pn)是引起严重侵袭性感染和上呼吸道感染最重要的病原体之一, WHO估计全球每年约有160万人死于肺炎链球菌引起的各种疾病,约100万病例为5岁以下儿童,而90%以上的死亡病例在发展中国家;随着耐药菌株的不断出现,肺炎链球菌感染的治疗面临越来越多的问题,有效的疫苗成为预防其感染的一个重要手段。目前,免疫途径的选择正在成为疫苗开发需要考虑的问题,与传统的肌肉注射免疫方式相比,粘膜免疫在产生局部免疫反应的同时,还可以刺激系统性免疫反应,对许多感染性疾病的防御都起重要作用,因此,WHO将粘膜免疫定为儿科疫苗发展的方向。溶血素(Pneumolysin, Ply)为肺炎链球菌的重要毒素之一,几乎存在于所有血清型的S.pn中,具有很好的保守性,最新研究报道显示,Ply在菌体表面存在表达。但是,由于Ply具有细胞毒性,必须对其优化。本课题组前期研究表明,第146位丙氨基酸缺失后可以导致Ply毒力和溶血活性完全丧失,并能诱导宿主产生保护性抗体,因此,突变的Ply是肺炎链球菌良好的疫苗候选蛋白,本课题拟研究ΔA146 Ply粘膜免疫对肺炎链球菌感染的保护作用。方法利用重组蛋白原核表达技术对第146位氨基酸缺失的Ply蛋白(ΔA146 Ply)进行体外表达,重组蛋白经粘膜途径免疫BALB/C小鼠,制备ΔA146 Ply特异性抗血清。SDS-PAGE及Western blot分析目的蛋白的表达及在六株常见致病性肺炎链球菌中的保守性,间接ELISA检测血清及唾液中ΔA146 Ply特异性抗体效价,并分析其产生IgG的亚型,同时,无菌操作获得免疫后小鼠脾细胞,检测其培养上清中相应的细胞因子水平。19F型S.pn鼻腔感染免疫后小鼠,取其鼻腔灌洗液和肺匀浆,铺板计数其中定植的细菌数量;致病性肺炎链球菌NCTC7466,CMCC(B)31436、CMCC(B)31207及CMCC(B)31614菌株经鼻腔感染免疫后小鼠,检测重组Ply蛋白对其在小鼠鼻咽部及肺部感染的保护作用并评价其主动免疫保护效果。进行体外抗黏附实验,检测ΔA146 Ply蛋白及其抗血清是否对肺炎链球菌R6黏附A549细胞具有抑制作用。结果包含肺炎链球菌ply(146位氨基酸突变)序列的重组工程菌BL21(DE3)经IPTG诱导得到大量以可溶形式表达的重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化,SDS-PAGE检测发现得到了纯度>95%的纯化蛋白。Western blot检测发现,Ply在六株常见的致病性肺炎链球菌NCTC7466,TIGR4,CMCC(B)31436、CMCC(B)31207,CMCC(B)31614及CMCC(B)31693中具有很好的保守性。重组蛋白经粘膜免疫BALB/C小鼠,检测其血清及唾液中特异性抗体发现,血清中ΔA146Ply特异性IgG效价高达5.12×10~5,唾液中IgG及IgA效价分别达到4.0×10~3和4.8×10~3;利用Santa公司羊抗鼠IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3二抗亚型检测免疫后血清中IgG亚型,结果显示,重组蛋白ΔA146 Ply粘膜免疫BALB/C小鼠主要刺激宿主产生IgG1,和IgG2b为主,提示宿主产生的免疫反应主要为Th2型。检测免疫后小鼠脾细胞培养上清中相应细胞因子水平发现,ΔA146 Ply粘膜免疫后刺激宿主产生了高水平的IL-17A,剂量高达678.55±189(pg/ml),峰值出现于刺激后48小时。CMCC(B)31693抗定植实验显示,ΔA146 Ply粘膜免疫后肺炎链球菌在小鼠鼻咽部及肺部的定植降低10-20倍(p<0.05)。致病性肺炎链球菌NCTC7466 , CMCC(B)31436、CMCC(B)31207及CMCC(B)31614菌株经鼻腔感染免疫后小鼠,检测其在小鼠鼻咽部及肺部的细菌数量发现,肺炎链球菌CMCC(B)31436及CMCC(B)31614在小鼠鼻咽部的定植降低20倍左右(p<0.05),肺炎链球菌NCTC7466,CMCC(B)314367及CMCC(B)31614在小鼠肺内的定植降低20-30倍(p<0.05)。主动免疫保护实验显示,重组蛋白ΔA146 Ply粘膜免疫可以有效延长小鼠生存时间,提高其生存率,其对肺炎链球菌NCTC7466,CMCC(B)31436、CMCC(B)31614及CMCC(B)31207的保护率分别为50%,41.7%,50%,41.7%。体外抗黏附实验结果显示,ΔA146 Ply特异性抗血清100倍、500倍、2500倍和10000倍稀释时,对肺炎链球菌R6对黏附A549细胞的抑制率分别为65%、60%、55%和35%;重组ΔA146 Ply蛋白在1μg/ml, 10μg/ml, 20μg/ml, 50μg/ml时对肺炎链球菌R6黏附A549细胞的抑制率分别为15%、20%、25%和30%。结论上述结果提示,ΔA146 Ply蛋白经粘膜免疫BALB/C小鼠可有效降低肺炎链球菌在宿主鼻咽部和肺部的定植,其保护作用可能依赖于高水平的IgA抗体及IL-17A;同时ΔA146 Ply蛋白粘膜免疫能有效保护宿主抵御四种致病性血清型S.pn的致死性感染,其保护作用可能依赖于小鼠体液免疫激活而产生的特异性抗体。