细胞表面展示技术(cell-surface display)是指利用基因工程重组技术将外源功能性蛋白定位并表达于微生物宿主细胞的细胞膜,细胞表面展示技术有运载蛋白和乘客蛋白两部分结构和宿主细胞组成,根据锚定单元的结构和性能的不同,将外源蛋白与载体蛋白序列的融合方法分为三种:三夹板融合式、C末端融合式、N末端融合式。Lpp-OmpA杂合体蛋白就是典型的C端融合载体蛋白。本课题通过对Lpp-OmpA杂合体蛋白结构的分析,构建一种将外源蛋白展示于外膜内表面的展示载体。通过分析大肠杆菌细胞壁的构造和传统Lpp-OmpA杂合体运载蛋白的空间结构,查找出跨膜部件OmpA(46-90)的基因序列,通过SOE-PCR法和PCR法扩增信号肽-9aa和信号肽-9aa-连接肽-OmpA(46-90)展示片段,并对展示片段基因两端进行改造,使其能够产生NdeⅠ酶切位点,通过限制性内切酶NdeⅠ将展示片段插入载体pET-DsbA-TD中。成功构建含有跨膜部件和不含跨膜部件的内表面展示载体。选用苏氨酸脱水酶作为乘客蛋白展示在外膜的内表面,抽提质粒转化表达宿主E.coli BL21(DE3),经0.4mM IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,并对展示的靶蛋白-苏氨酸脱水酶进行活性初步测定,筛选出结构更加有优势的展示载体。选出L-天冬氨酸β-脱羧酶(Asp)作为乘客蛋白蛋白对内表面展示载体pET-Lpp的表达性能进行评价,设计引物从表达性载体ZW中扩增出酶基因,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,重组至载体pET-Lpp中,构建重组子。经过菌落PCR筛选出阳性克隆,抽提阳性克隆质粒转化表达宿主E.coli BL21(DE3),构建工程菌。经0.4mM IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,并用纸层析法对展示的Asp进行活性测试,发现展示的靶蛋白的具有活性,且热稳定性良好。通过比较发现,固定在内表面的Asp活性比分泌在周质的Asp活性高。