枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种极具潜力的外源蛋白表达宿主菌，不论是用来高效表达外源蛋白还是作为口服疫苗或全细胞酶的载体，都展现出其他细菌无可比拟的优势，是研究较多、应用广泛的生物安全菌。质粒是外源蛋白异源表达的必须工具，目前，可用于外源蛋白在B. subtilis中表达的质粒虽然不少，但遗传操作方便、表达效率高的E. coli-B. subtilis穿梭表达载体和能直接将外源蛋白展示在芽孢表面的穿梭表达载体仍然缺乏。本实验构建了两个穿梭表达载体和一个表面展示的载体，用4种报告基因进行了验证，主要内容如下：1.通过融合PCR将来源于B. subtilis的木糖启动子（PxylR）序列和来源于大肠杆菌（Escherichia coli）表达载体pET21b的T7肽和多克隆位点区等序列融合替换了E. coli-B. subtilis穿梭载体pHT315的多克隆位点，构建了一个能由D-木糖诱导表达的E. coli-B. subtilis穿梭表达载体pTL。PCR扩增得到了绿色荧光蛋白（GFP）基因gfp，β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因gus，人淀粉样前体蛋白(APPsw)基因APPsw和粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）脂肪酶基因lipa，并分别插入pTL的多克隆位点构建了重组质粒，转化B. subtilis WB800，获得了工程菌WB800-gfp、WB800-gus、WB800-APPsw和WB800-lipa。荧光显微镜下可以观察到WB800-gfp菌体发出绿色荧光，表明GFP成功表达，用荧光分光光度法确定了检测GFP的最佳激发波长为390nm，发射波长为507nm；以gfp为报告基因，利用荧光分光光度法经初步优化得到GFP在WB800-gfp中诱导表达条件为：在37℃、200rpm条件下，以终浓度1%的D-木糖诱导8h，GFP表达水平最高；上述条件下诱导gus、APPsw、lipa基因表达，WB800-gus菌体呈现蓝色阳性反应，Western Blot试验结果表明WB800-APPsw菌体裂解液样品在85kDa处有明显的阳性蛋白杂交条带，Rashid N p-NPP比色法检测WB800-lipa菌体裂解液样品，结果显示脂肪酶活力为72.73±0.25U/mg，较未经木糖诱导的对照提高近210倍，表明三种基因都得到很好地表达；在无抗生素选择压力的条件下，质粒pTL经连续传10代后仍表现出98.5%的高稳定性。上述结果证明pTL是一个遗传操作方便、稳定性强、表达效率高的E. coli-B. subtilis穿梭表达载体，可以表达融合有T7肽的外源融合蛋白，不影响蛋白性质，同时可为后续回收纯化操作提供便利。2.在B. subtilis的穿梭表达载体pDG148-stuI的基础上，经遗传改造构建了一个含有Pspac启动子的E. coli-B. subtilis穿梭载体pDG150，将克隆的gfp，gus，APPsw和lipa插入pDG150构建重组质粒，分别转化B. subtilis168，获得了重组工程菌B168-gfp，B168-gus，B168-APPsw和B168-lipa。荧光显微镜观察和荧光分光光度计检测结果表明GFP在B168-gfp中获得表达，以gfp为报告基因，利用荧光分光光度法证明用IPTG诱导B168-gfp中GFP表达的最优条件为：在37℃、200rpm转速下，终浓度1mM的IPTG诱导4h，可使GFP表达量最高。在此培养条件下，GUS显色法证明B168-gus中GUS表达为阳性；Western Blot实验显示B168-APPsw菌体裂解液样品在78kDa处有阳性蛋白杂交条带，表明APPsw得到表达；Rashid N p-NPP比色法证明B168-lipa脂肪酶也获得高效表达，IPTG诱导后的脂肪酶活力为20.52±0.12U/mg，较未经诱导的对照提高近50倍；质粒传代稳定性实验表明：经连续传10代后质粒稳定性高达95.5%。3.将芽孢衣壳蛋白CotG的启动子序列和蛋白编码序列（不含终止密码子）与质粒pDG150重组构建了表面展示载体pDG150-cotg，将gfp，gus，APPsw和lipa插入pDG150-cotg构建重组质粒，分别转化B. subtilis168，得到重组工程菌G168，U168，A168和L168。37℃、200rpm条件下在DSM培养基中培养40h收获重组工程菌的芽孢。荧光显微镜观察结果证明GFP在G168芽孢上得到成功展示；U168的芽孢加入GUS显色液后呈蓝色，表明GUS已经表达；Western Blot试验表明A168的芽孢提取液在102kDa处有阳性蛋白杂交带，说明APPsw蛋白得到成功展示，为APPsw抗体制备打下了基础；利用Rashid N p-NPP比色法检测L168的芽孢，表明脂肪酶活力为28±1.32U/g。