第一部分、心肌营养素对阿尔茨海默症转基因小鼠模型的作用及机制研究　　 背景：心肌营养素（Cardiotrophin-1，CTF1）作为一种多效细胞因子，抗凋亡、抗氧化，对神经细胞具有保护作用，并且可以延缓运动系统退行性疾病进程。中枢神经组织表达分泌CTF1，但CTF1对中枢神经退行性疾病的作用及机制未见报道。本实验构建脑组织特异的CTF1转基因小鼠，研究该基因对APPswe/PS1dE9阿尔茨海默症的作用以及机制研究。　　 方法：免疫印迹和组织化学检测CTF1在野生型C57BL/6J小鼠和APPswe/PS1dE9阿尔茨海默症模型小鼠脑组织中时程表达变化。脑组织特异的高表达CTF1转基因小鼠与APPswe/PS1dE9转基因小鼠杂交获得双转基因小鼠。开放旷场实验观察WT、APPswe/PS1dE9、CTF1及CTF1×APPswe/P1S1dE9小鼠自主活动的改变，Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力。硫磺素-S荧光染色观察老年斑的改变。PET-CT观察葡萄糖摄取情况。Westernblotting检测WT、APPswe/PSldE9、CTF1及CTF1×APPswe/PS1dE9小鼠脑组织CTF1信号分子ERK1/2、Akt、、JAK/Stat3的表达水平以及GSK3β下游靶分子葡萄糖转运蛋白.1(GLUT-1)和葡萄糖转运蛋白-3(GLUT-3)的表达。重组人CTF1刺激SH-SY5Y细胞，Westernblotting检测GSK3β和GLUT-3的表达变化。使用GSK3p和GLUT-3抑制剂检测CTF1刺激SH-SY5Y后葡萄糖摄取。透射电镜分析海马神经元超微结构改变。双向凝胶电泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)分离WT、APPswe/PS1dE9、CTF1及CTF1×APPswe/PS1dE9小鼠脑组织蛋白，免疫印迹检测脑组织线粒体电压依赖性阴离子通道蛋白质(voltage-dependentanionchannel，VDAC)的磷酸化水平。分离WT、APPswe/PS1dE9、CTF1及CTF1×APPswe/PS1dE9小鼠脑组织中线粒体，Westernblotting检测己糖激酶I(Hexokinase，HKI)和细胞色素c(Cytochromec，Cytc)的分布改变。　　 结果:免疫印迹结合免疫组化结果显示，野生小鼠CTF1的表达水平随着月龄的增加表达逐渐减少；与同月龄野生小鼠相比,3、6、9月龄APPswe/PS1dE9阿尔茨海默症模型小鼠脑组织中CTF1表达下调。建立脑组织特异的CTF1×APPswe/PS1dE9双转小鼠，6月龄小鼠行为学结果显示，开放旷场实验中与同月龄野生小鼠相比，APPswe/PS1dE9转基因小鼠自主活动增加（垂直方向增加54％，水平方向增加了27.4％），趋触性减少（中心区域活动时间增加了1倍），不活跃、活跃和高度活跃频次以及活跃变换总频次均增加。与APPswe/PS1dE9转基因小鼠相比，CTF1×APPswe/PS1dE9双转小鼠自主活动减少（垂直方向减少了12％，水平方向减少了17.9％），趋触性增加（中心区域活动时间减少了46.2％），不活跃、活跃和高度活跃频次以及活跃变换总频次均减少。Morris水迷宫平台隐藏实验中，CTFI×APPswe/PS1dE9双转小鼠较之APPswe/PS1dE9转基因小鼠寻找平台时间缩短；在空间探索实验中CTF1×APPswe/PS1dE9双转小鼠在目标象限停留时间增加了41.4％，穿越目标象限的频次增加了47.9％。硫磺素.S荧光染色发现CTF1×APPswe/PS1dE9双转小鼠海马老年斑数量以及面积减少了35.8％和18.2％，皮层的老年斑数量以及面积减少了41.9％和26.9％。PET观察脑组织葡萄糖摄取实验结果显示，与野生对照小鼠相比，APPswe/PSldE9转基因小鼠脑组织额叶葡萄糖摄取减少了38.3％，颞叶减少了46.4％，海马减少了44.8％；与APPswe/PS1dE9转基因小鼠相比，CTF1×APPswe/PS1dE9双转小鼠额叶葡萄糖摄取增加了了37.7％，颞叶增加了50.8％，海马增加了53.2％。APPswe/PS1dE9转基因小鼠脑组织中P-GSK-3p和GLUT-3水平相对于野生小鼠显著下降，而在CTF1×APPswe/PS1dE9双转小鼠中P-GSK-3β和GLUT-3表达水平均升高。重组hCTF1刺激细胞后，P-GSK-3β和GLUT-3的表达水平上调，葡萄糖摄取增加。GSK-3β和GLUT-3受到抑制后可以逆转hCTF1引起SH-SY5Y细胞葡萄糖摄取的增加。电镜超微结构观察到APPswe/PS1dE9转基因小鼠海马CA1区神经元胞体中线粒体肿胀，嵴断裂，神经突里的线粒体电子密度升高，神经突里的轴丝未见异常，而CTF1转基因可以缓解APPswe/PS1dE9转基因小鼠神经元线粒体的结构异常。2-DE结合免疫印迹显示APPswe/PS1dE9转基因小鼠脑组织线粒体中VDAC苏氨酸磷酸化水平升高，而CTF1及CTF1×APPswe/PS1dE9小鼠脑组织中VDAC苏氨酸磷酸化水平下调。与WT小鼠相比，APPswe/PS1dE9转基因小鼠神经元线粒体中HKI和Cytc释放到胞浆，引起胞浆中HKI和Cytc含量升高；与APPswe/PS1dE9转基因小鼠相比，CTF1×APPswe/PS1dE9双转小鼠神经元胞浆中HKI和Cytc含量降低，线粒体中含量恢复至正常水平。　　 结论:CTF1转基因可明显改善APPswe/PS1dE9转基因小鼠异常的自主活动和学习记忆能力损伤。CTF1抑制脑组织GSK-3β活性，上调GLUT-3表达升高，增加葡萄糖摄取；通过抑制GSK-3β活性，抑制VDAC磷酸化引起线粒体mPTP的过度开放，减少Cytc的释放，缓解线粒体结构和功能异常，改善阿尔茨海默症的能量代谢障碍。因此，CTF1有望成为治疗阿尔茨海默症的候选营养因子。　　 第二部分、柚皮苷对阿尔茨海默症转基因小鼠模型的治疗作用及机制究　　 背景：柚皮苷Naringin具有的神经保护作用，可以延缓神经退行性疾病进程。然而关于柚皮苷对中枢神经疾病的作用研究都集中在其抗氧化能力上，对其它机制及潜在的治疗作用未见报道。本实验利用APPswe/PS1dE9阿尔茨海默症转基因小鼠模型，多个层次研究其药理作用并进行机制的研究。　　 方法：APPswe／PS1dE9转基因痴呆模型小鼠随机分组，每组12只，雌雄各半，并选择12只野生鼠作为对照组，这些小鼠在性别、体重相匹配，将模型小鼠分为4组：AD安慰剂组、安理申治疗组(2mg／kg／d)、柚皮苷治疗组(50mg／kg／d)、柚皮苷治疗组(100mg／kg／d)。安慰剂组及对照组小鼠给予常规的标准鼠粮，安理申治疗组和柚皮苷治疗组在常规的标准鼠粮中加入相应剂量的药物，小鼠每天鼠粮的摄入量按下列计算：每只体重为209的小鼠，每天摄入鼠粮为39，选择3月龄小鼠给药，治疗时间为16周，给药后进行行为学实验。免疫组织化学检测老年斑变化，PET观察葡萄糖摄取情况，免疫印迹检测脑组织p-GSK-3p，p-CaMKⅡ，p-AMPA的表达。免疫印迹检测脑组织COX-2，iNOS的表达；LPS诱导BV-2细胞炎症反应，免疫印迹检测Naringin对COX-2，iNOS的抑制作用。　　 结果：行为学实验开放旷场中，APPswe/PS1dE9小鼠趋触性减少，不活跃、活跃和高度活跃频次以及活跃变换总频次增加。与APPswe／PS1dE9小鼠相比，柚皮苷治疗组(Naringin50和Naringin100)小鼠趋触性增加，不活跃、活跃和高度活跃频次以及活跃变换总频次减少。与APPswe/PS1dE9小鼠相比，避暗实验中，Naringin100治疗小鼠进入暗室潜伏期延长94.6％，错误次数减少59.2％。Morris水迷宫平台隐藏实验中，Nafingin100小鼠寻找平台时间缩短；在空间探索实验中穿越目标象限的频次增加了60.7％。硫磺素-S荧光染色发现Naringin100治疗小鼠海马老年斑数量减少26.4％，老年斑面积减少32.9％。PET观察脑组织葡萄糖摄取实验结果显示，APPswe/PS1dE9阿尔茨海默症转基因小鼠脑组织额叶葡萄糖摄取减少了38％，颞叶减少了44％，海马减少了41％；Naringin100治疗小鼠额叶葡萄糖摄取增加了72.5％，颞叶增加了61％，海马增加了62％。APPswe伊S1dE9转基因小鼠脑组织中P-GSK-3p，P-CaMKⅡ，P-AMPA水平相对于野生小鼠显著下降，而Naringin100治疗小鼠P-GSK-3B，P-CaMKⅡ，P-AMPA水平表达水平均升高。在体外Naringin100可以抑制LPS诱导的炎症因子COX-2，iNOS的表达，而在体内Naringin100并不能抑制APPswe／PS1dE9转基因小鼠脑组织中活化的炎症因子。　　 结论：Naringin抑制脑组织GSK-3β活性，减少老年斑，缓解糖摄取障碍；活化CaMKⅡ改善长时程记忆，进而调节改善阿尔茨海默症的病理发展，明显改善APPswe／PS1dE9异常的自主活动以及认知功能障碍。因此，Naringin有可能成为治疗阿尔茨海默症的候选中药单体。　　 第三部分、柚皮苷与吴茱萸碱联合用药对阿尔茨海默症转基因小鼠模型学习记忆能力的影响　　 背景：炎症以及氧化应激在阿尔茨海默氏症疾病的发生和发展中发挥着重要作用，中药单体吴茱萸碱(Evodiamine)具有较强的抗炎作用，而柚皮苷(Naringin)则具有较强的抗氧化特性和改善线粒体功能障碍的作用，本实验采用柚皮苷与吴茱萸碱联合用药对APPswe／PS1dE9转基因痴呆模型小鼠学习记忆能力的影响，探讨柚皮苷与吴茱萸碱联合用药是否具有协同作用。　　 方法：APPswe／PS1dE9转基因痴呆模型小鼠随机分组，每组12只，雌雄各半，并选择12只野生鼠作为对照组，这些小鼠在性别、体重相匹配，选择在3月龄开始进行治疗，给药16周后进行水迷宫实验，以安理申作为阳性药对照，并与安慰剂组小鼠进行比较，各给药组按设定剂量分别单独或联合加入鼠粮中。　　 结果：给药16周后，单独使用柚皮苷和吴茱萸碱缩短寻找平台的潜伏期分别为32％和10％。柚皮苷与吴茱萸碱联合应用能够显著缩短寻找平台的潜伏期47％。　　 结论：单独使用柚皮苷或吴茱萸碱均能改善痴呆模型小鼠的学习记忆能力；柚皮苷与吴茱萸碱联合应用能够显著改善APPswe／PS1dE9痴呆模型小鼠的学习记忆能力，但联合用药组并未表现出强于单独给药组的协同保护效应。