前言　　 分化的胚胎软骨细胞基因(Differentiated Embryonic Chondrocyte gene,DEC)1(别名BHLHE40/Stral3/Sharp2)和DEC2(别名BHLHE41/Sharp1)属于碱性螺旋-环-螺旋类转录因子。DEC1和DEC2广泛表达于多种组织和细胞中,并参与调节多种生物学功能。作为重要的生物钟节律调节因子,有关DEC在生物钟节律调节方面的功能已有相当报道,对解释正常机体的生理、生化、某些行为现象以及因昼夜节律紊乱而引发的病理生理过程,乃至提出相应的防治措施等都有重要的理论意义和应用价值。　　 除参与生物钟节律的调节之外,DEC还参与细胞凋亡的诱导,细胞增殖的调控,肿瘤的恶性进展以及对低氧状态的反应。有研究表明,在乳腺癌及结肠癌组织标本中,DEC1在癌组织中的表达显著高于其在同一标本非癌组织中的表达;而在低氧环境下,DEC2可以抑制血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)的表达;DEC对其下游目的基因的调控主要通过依赖及非依赖E-box的方式进行。　　 关于DEC在细胞凋亡过程中的作用也有相应报道,不同的研究甚至得到相反的结论,如在离子辐射诱导的小鼠成纤维细胞系NIH3T3细胞凋亡过程中,DEC1发挥促细胞凋亡的作用;而血清饥饿诱导的人胚肾细胞系HEK293细胞凋亡过程中,DEC1具有抑制细胞凋亡的作用;DEC1同样参与调节经转化生长因子(Transforming growth factor,TGF-β)诱导的小鼠乳腺癌细胞凋亡过程。　　 紫杉醇(paclitaxel,PTX)是提取自太平洋紫杉树树皮的典型紫杉烷类化疗药物。研究表明,紫杉醇可以影响Bcl-2、Bcl-xL的表达、c-Jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化、半胱氨酸激酶(caspases)的活化和聚(腺苷二磷酸-核糖)多聚酶(PARP)的水解活性,从而诱导依赖或非依赖p53机制的细胞凋亡。此外,紫杉醇能抑制细胞有丝分裂过程中纺锤体的形成,使细胞阻滞于G2/M期,进而导致细胞凋亡。　　 顺铂(cisplatin或CDDP)是另外一种临床一线抗肿瘤药物,其抗癌机制主要是促使DNA双链发生交联,从而抑制DNA复制以及转录过程而导致细胞死亡。CDDP处理可以影响有丝分裂原活化的蛋白激酶(MAPKs),p53,Bax,Bcl-2,Bcl-xL,Bim,PERIOD(PER)1,PER3的表达以及caspase的活化和PARP的裂解。迄今为止,在抗肿瘤药物紫杉醇或顺铂诱导的肿瘤细胞凋亡过程中,DEC1及DEC2是否发挥相应的调节作用及其作用机制还不清楚,有待进一步阐明。　　 本研究目的旨在探讨DEC在乳腺癌细胞系及口腔癌细胞系中的表达以及在抗肿瘤药物诱导的细胞凋亡中的作用。在细胞水平上,通过瞬时干扰或过表达DEC1及DEC2的表达,分析其对凋亡相关蛋白表达的影响。运用细胞免疫荧光化学染色技术探讨抗肿瘤药物对DEC在细胞内定位及表达的影响。　　 方法　　 1、细胞培养及药物处理　　 人乳腺癌细胞系MCF-7、人口腔癌细胞系HSC-3和CA9-22培养于含10%灭活胎牛血清的DMEM高糖培养基中,贴壁生长,每3-4天胰酶消化传代一次。细胞经不同浓度的紫杉醇或顺铂处理2小时或24小时。　　 2、实时定量聚合酶链式反应或逆转录-聚合酶链式反应　　 使用Trizol试剂提取细胞总RNA,利用Rever-Tra Ace进行cDNA第一链的合成。设计DEC1和DEC2引物,分别用于实时定量聚合酶链式反应和逆转录.聚合酶链式反应,内参分别选择18s和GAPDH。　　 3、小干扰RNA(siRNA)及质粒构建、转染　　 针对DEC1及DEC2的小干扰RNA由Qiagen合成,使用LipofectamineiMAX转染试剂将小干扰RNA转染至乳腺癌细胞系MCF-7中。将DEC1和DEC2的过表达质粒导入感受态宿主细菌DH5a中扩增,纯化,测序验证后,使用Lipofectamine LTX转染试剂将质粒分别转染至口腔癌细胞系HSC-3及CA9-22中,通过Western Blot鉴定转染效率。　　 4、Western Blot　　 将含有10μg总蛋白的裂解产物进行SDS-PAGE电泳后,转印至PVDF膜,多克隆抗体DEC1或DEC2于4℃摇床孵育过夜,辣根过氧化酶标记二抗室温条件下孵育1小时后ECL显色。　　 5、免疫荧光染色　　 细胞接种于4孔chamber slide中,加入药物处理24小时。4%多聚甲醛固定30分钟后,用DAPI进行细胞核染色,加入0.2%Triton X/PBS处理30分钟,非免疫动物血清封闭30分钟,一抗为兔抗人多克隆抗体DEC1和DEC24℃孵育过夜;二抗为Alexa488标记的抗兔IgG,37℃避光孵育1小时。共聚焦显微镜(Zeiss,LSM710,德国)下观察荧光信号,并进行图像采集。阴性对照实验:用等量的0.01mol/L PBS代替一抗。　　 6、MTS法检测细胞活力　　 取对数生长期的口腔癌细胞悬液(细胞密度3×105个/ml)分别接种于96孔板培养板,每板分3组:CDDP未处理组、50μMCDDP处理组及100μMCDDP处理组,其中每组又包含转染空质粒组及转染DEC2过表达质粒组。于转染24小时后加入CDDP继续处理24小时,之后每孔加入20μl四甲基偶氮唑盐化合物[3-(4,5-dime-thylthiazol-2-y1)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,inner salt;MTS(a)]试剂,37℃避光孵育1小时后,测定490nm波长条件下各孔吸光度。实验重复三次。　　 7、统计分析　　 应用Studentst-test进行统计分析。P＜0.05有统计学意义。　　 结果　　 1、紫杉醇上调了DEC1和DEC2在乳腺癌细胞MCF-7中的表达水平　　 我们检测了MCF-7细胞中,紫杉醇是否影响DEC1及DEC2的表达。在培养的MCF-7细胞中加入不同浓度紫杉醇作用2小时后对DEC1、DEC2蛋白表达水平及caspase-8和PARP的水解活性无影响。然而,作用24小时之后,上述蛋白表达水平显著增高。50μM浓度的紫杉醇处理24小时后,p53蛋白表达水平轻度升高,而Bcl-2蛋白表达水平降低。另外,经紫杉醇作用24小时后,DEC1及DEC2的mRNA表达水平也显著增高。　　 2、DEC1表达缺失与DEC2表达缺失对紫杉醇诱导的MCF-7细胞凋亡具有相反的调节作用。　　 转染siRNA-DEC1下调DEC1的表达后,因紫杉醇诱导而增加的caspase-8、PARP的水解活性及p53蛋白的表达水平受到抑制,而被紫杉醇抑制的Bcl-2蛋白的表达水平则有所增加。另一方面,无论紫杉醇作用与否,转染siRNA-DEC2下调DEC2的表达均增加了caspase-8、PARP的水解活性及p53蛋白的表达水平,同时抑制了Bcl-2蛋白的表达水平。　　 3、紫杉醇对DEC1及DEC2蛋白亚细胞定位的影响。　　 细胞免疫荧光化学染色结果表明,经紫杉醇处理24小时后,DEC1蛋白在细胞核中的表达水平升高,而DEC2蛋白在细胞核及细胞浆中的表达水平同时升高。　　 4、siRNA-DEC2增加了紫杉醇诱导的细胞核固缩,siRNA-DEC1减少了紫杉醇诱导的细胞核固缩。　　 细胞核固缩现象被认为是凋亡细胞的特征之一。我们发现,在经紫杉醇处理24小时后,MCF-7细胞中出现了细胞核固缩现象。siRNA-DEC1在一定程度上抑制了紫杉醇诱导的MCF-7细胞核固缩现象。而单独转染siRNA-DEC224小时后,MCF-7细胞即出现核固缩,同时,siRNA-DEC2增强了紫杉醇诱导的MCF-7细胞凋亡。这一现象与Western Blot实验中显示的结果相一致。　　 5、人口腔癌细胞系CA9-22和HSC-3中,顺铂对DEC1和DEC2表达的影响。　　 采用不同浓度的顺铂分别作用于口腔癌细胞系CA9-22和HSC-3。我们发现,50μM和100μM浓度的顺铂作用24小时后,PARP水解活性及BimEL剪切体的活性增强,但是却降低了CA9-22细胞中内源性DEC1和DEC2在基因及蛋白质水平上的表达。而HSC-3细胞经10μM浓度的CDDP处理后cleaved-PARP和BimEL的活性轻度增强,且20μM及50μM浓度的CDDP显著增强了二者的活性;同时,经CDDP处理后,DEC1的表达水平降低,而DEC2的表达水平却明显升高。　　 6、HSC-3细胞中,DEC2抑制CDDP诱导的Bim表达及细胞凋亡　　 在CA9-22细胞中,DEC2过表达时,无论CDDP存在与否,其对cleaved-PARP、caspase-3、caspase-8和Bim(EL,L,S)均没有明显影响。相反,在HSC-3细胞系中,当DEC2过表达合并CDDP(20或50mM)作用时,cleaved-PARP、caspase-3、caspase-8和Bim(EL,L,S)的活性均明显降低。另外,DEC2的过表达并不影响Bid和Bax的表达。同时,在上述两种细胞系中,DEC1的过表达无论是否合并CDDP处理,其对凋亡相关蛋白均无明显影响。　　 7、CDDP对细胞核/浆中DEC的影响　　 采用间接免疫荧光染色法检测了CDDP是否影响细胞核及细胞浆中DEC1和DEC2的表达水平。在CA9-22和HSC-3细胞中,CDDP对细胞核及细胞浆中DEC1的表达量没有明显影响,而其对HSC-3细胞系中DEC2的表达却产生具有显著差异的影响。CDDPS对CA9-22细胞中DEC2在细胞核/浆中的表达影响也不大。　　 8、DEC2过表达可抑制HSC-3细胞发生凋亡　　 在CA9-22细胞中,DEC2的过表达合并CDDP处理对细胞活性几乎没有影响,相反,与对照组细胞活性相比,两者的联合作用却明显增加了HSC-3细胞的活性。在CDDP缺失的条件下,DEC2过表达对细胞活性的影响也很小。　　 结论　　 1、抗癌药物紫杉醇诱导的乳腺癌细胞MCF-7凋亡过程中,DEC1和DEC2发挥相反的调节作用。　　 在p53野生型细胞系MCF-7中,DEC1通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达而发挥促进紫杉醇诱导的细胞凋亡的作用;DEC2则通过直接或间接抑制半胱氨酸激酶(caspase-8)的活性而发挥抑制细胞凋亡的作用。　　 2、在抗癌药物顺铂诱导口腔癌细胞HSC-3凋亡的过程中,DEC2发挥抑制细胞凋亡的作用。　　 顺铂诱导CA9-22细胞凋亡的同时,抑制了DEC1和DEC2表达水平,且DEC1和DEC2的过表达对细胞凋亡过程没有明显影响。而在HSC-3中,顺铂抑制了DEC1的表达,却增加了DEC2的表达;DEC1过表达对细胞凋亡过程没有影响,而DEC2过表达明显抑制了细胞凋亡过程,而这一作用主要通过抑制促凋亡蛋白Bim的表达而实现。　　 3、DEC在细胞凋亡过程中发挥不同的调节作用,这可能与细胞系之间基因表达模式的不同以及处理方式和有关。