前言:　　 JC病毒(John Cunningham virus,JCV)是多瘤病毒家族成员之一,还包括SV40和BK病毒。血清学调查显示,普通成人JCV感染率高达80-90%。当机体免疫力低下时,JCV大量繁殖可损伤神经系统,导致进行性多灶性白质脑病(PML),若整合到人类基因组可导致肿瘤发生。静脉和颅内注入JCV或将JCVT抗原转入基因组后均可诱发多种神经系统肿瘤,也有实验结果表明JCVT抗原的存在与结肠癌、食道癌、肺癌、口腔舌、咽鳞癌和前列腺癌发生关系密切。研究发现SV40病毒T抗原与JCVT抗原的同源性可达80%,SV40T抗原诱发的晶状体肿瘤在1年后发生淋巴结和肺转移。本研究利用晶状体α-crystallin和胃粘膜K19特异启动子构建JCVT抗原高表达转基因鼠,建立JCVT抗原诱导自发肿瘤动物模型。分析JCVT抗原诱导自发肿瘤的分子病理学特点及JCVT抗原RNA选择性剪接在肿瘤形成中的作用。　　 材料与方法:　　 1、构建α-crystallin-JCVT抗原、K19-JCVT抗原和pEGFP-N1-JCVT抗原表达质粒。　　 2、显微注射,制备α-crystallin-JCVT抗原和K19-JCVT抗原转基因鼠,各个品系PCR鉴定阳性鼠仔与野生鼠交配繁育,几代后反交配制备并筛选纯合鼠,比较a-erystallin-JCVT抗原纯合鼠与杂合鼠的发瘤时间。　　 3、提取α-crystallin-JCVT抗原纯合鼠尾DNA,普通PCR和点杂交检测JCVT抗原的存在,实时PCR检测各个品系JCVT抗原的拷贝数。　　 4、摘取α-crystallin-JCVT抗原转基因鼠明显肿瘤样改变的眼球和脑组织,固定制作成石蜡标本,进行HE染色,T抗原、p53和β-catenin免疫组化和T抗原的免疫荧光染色。　　 5、对于严重肿瘤样改变的α-crystallin-JCVT抗原转基因鼠,使其俯卧位进行核磁共振检测,尸检后HE染色或T抗原免疫组化确定晶状体肿瘤细胞是否发生脑侵袭。　　 6、提取K19-JCVT抗原转基因鼠的胃和肺组织,固定制作成石蜡标本,进行HE、免疫组化和原位杂交检测确定T抗原的存在及定位。　　 7、提取α-crystallin-JCVT抗原转基因鼠眼肿瘤组织和K19-JCVT抗原转基因鼠胃组织总RNA,逆转录合成cDNA,并设计跨内含子引物,同时PCR扩增两种转基因鼠的cDNA,检测JCVT抗原的选择性剪接是否存在组织特异性。　　 8、培养消化道癌细胞、神经系统肿瘤细胞、肺癌细胞、子宫内膜癌细胞、人胚肾细胞、人胚肾上皮细胞、鼠成纤维细胞和人晶状体上皮细胞,并用pEGFP-N1-JCVT抗原质粒进行转染,荧光显微镜观察T抗原表达情况,RT-PCR确定JCVT抗原RNA选择性剪接是否存在细胞特异性。　　 结果:　　 1、成功构建α-crystallin-JCVT抗原、K19-JCVT抗原和pEGFP-N1-JCVT抗原表达质粒,经酶切鉴定测序,Blast比对序列及方向均正确。　　 2、获得5个品系的α-crystallin-JCVT抗原转基因原代鼠和4个品系的K19-JCVT抗原转基因原代鼠,经繁育后已筛选出纯合鼠。α-crystallin-JCVT抗原转基因纯合鼠的发瘤时间早于杂合鼠。　　 3、普通PCR和点杂交结果显示,αAT-1、αAT-2、αAT-4、αAT-5四个品系的鼠均有T抗原的存在,实时PCR结果显示α-crystallin-JCVT抗原的五个品系中2号鼠(αAT-2)的拷贝数最高,aAT-5次之。　　 4、JCVT抗原定位于α-crystallin-JCVT抗原肿瘤细胞的细胞核内,表达水平极强,肿瘤细胞中p53呈核强阳性表达,β-catenin蛋白主要定位在细胞膜和细胞质中。脑肿瘤组织的免疫组化可证实晶状体肿瘤细胞是以侵袭的方式进入脑组织。　　 5、核磁共振(MRI)支持了晶状体肿瘤细胞是以侵袭的方式进入脑组织。　　 6、K19-JCVT抗原转基因鼠胃组织HE染色发现有肿瘤细胞的存在,免疫组化显示T抗原定位在细胞核,原位杂交提示JCVT抗原mRNA在胃粘膜上皮细胞质中呈强阳性表达,18个月龄纯合鼠出现了肺癌。　　 7、跨内含子引物扩增α-crystallin-JCVT抗原转基因鼠尾和K19-JCVT抗原转基因鼠胃组织cDNA结果显示,扩增目的条带一致且均发生了选择性剪接。　　 8、pEGFP-N1JCVT抗原质粒转染的各细胞,RT-PCR结果显示均有T抗原的表达,不存在细胞特异性。　　 结论:　　 1、JCVT抗原嵌入基因组后可以诱发晶状体肿瘤和肺癌。　　 2、JCVT抗原诱发晶状体肿瘤是通过视神经孔入脑的。　　 3、JCVT抗原内含子选择性剪接无细胞特异性。