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背景:西尼罗病毒(West Nile Virus,WNV)感染一般不会引起疾病,少部分可能会引起西尼罗热(West Nile Fever,WNF)或者西尼罗脑炎等疾病,严重者有可能危及到病人的生命。WNV流行广泛,对世界范围内的公共卫生安全问题提出了严峻的挑战,中国虽然尚未发生WNV的流行与传播,但在新疆等地的蚊虫标本中已检测出该病毒。重组酶介导的核酸扩增(Recombinase aided amplification,RAA)技术是一种新型的基于重组酶的等温核酸扩增技术,该技术在37-42℃的温度下30分钟之内就可实现对目的片段的大量扩增,并可结合荧光技术、电泳技术和侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)技术实现对病原体的快速检测。柯萨奇病毒A组6型(coxsackie virus,CV-A6)是我国近几年引起儿童手足口病的重要病源之一,严重威胁着我国儿童的身体健康。因此对于CV-A6的研究也成为近几年的热点,然而,由于实验室安全事件频发,人们对于实验室安全越来越重视。因此在CV-A6的研究过程中,做好病毒的灭活和常规消毒工作至关重要。目的:1、本研究利用双通道RT-RAA技术建立快速检测WNV的方法。结合荧光技术建立一种实时荧光RT-RAA检测方法,结合侧流层析试纸条建立一种可视化检测方法,并对建立的两种检测WNV的方法做初步的评价。2、评价CV-A6的热力灭活并和实验室常见的两种含氯高效消毒剂的灭活效果比较,为在二级生物安全实验室从事肠道病毒实验活动后的消毒工作提供基础数据。方法:1、WNV的实时荧光RT-RAA 检测方法:(1)查阅文献,下载病毒的基因序列进行比对,在保守和特异的序列处设计引物和探针;(2)依据RAA引物和探针设计原则,利用相应的软件设计3对引物和1个探针;(3)用WNV重组质粒标准品进行引物探针筛选,筛选出最佳的引物探针组合,并对其特异性和灵敏性进行初步评价。(4)利用本科室已设计好的玫瑰花环病毒的一段序列为内参探针,并构建内参质粒,对双重RAA的特异性和灵敏性进行初步评价。(5)采用已建立好的RT-RAA检测WNV的方法和实时荧光RT-q PCR方法平行检测蚊虫标本,对该方法做初步评价。WNV的RT-RAA-LFD检测方法:(1)依据RAA-LFD引物探针设计原则,在荧光RT-RAA最优引物探针的基础上进行修改,建立RT-RAA-LFD检测WNV的方法,并对其特异性和灵敏性进行初步评价(3)检测32份蚊虫标本并与RT-q PCR方法比较,对该方法进行评价。2、分别在不同温度、不同消毒剂浓度和不同的灭活时间下处理一定滴度的CV-A6病毒,将灭活处理后的病毒接种于96孔细胞培养板中培养7天,逐日观察并记录细胞病变效应,最后计算灭活后病毒的滴度并分析。结果:1.本研究建立了实时荧光RT-RAA和RT-RAA-LFD检测WNV的等温核酸检测方法,该方法在39℃的温度下30分钟内即可完成对WNV的检测,其中实时荧光RT-RAA检测法的灵敏度为10 copies每反应,RT-RAA-LFD检测方法的灵敏度为1000copies每反应,两种方法的特异性好,与其它常见的黄病毒属的病毒和虫媒病毒不存在交叉反应。采用这两种方法检测32份蚊虫标本,结果显示为5份阳性和27份阴性,与RT-q PCR检测结果一致。2.56℃条件下灭活20min可以有效(灭活前后病毒滴度的差值≥4认为有效)灭活CV-A6病毒,65℃条件下30 min和72℃条件下10 min即可完全灭活该病毒;市售利尔康三氯异氰尿酸泡腾消毒片和84消毒液在产品推荐的有效氯浓度下,1分钟即可完全灭活CV-A6病毒。结论:1.本研究建立了检测WNV的实时荧光RT-RAA和可视化RT-RAA-LFD的方法,该方法具有灵敏度高、特异度好、快速简便、易于操作和价格低廉等优点,克服了传统PCR需要昂贵和大型的仪器设备来实现精确的变温控制的缺点,具有在现场和偏远地区应用的潜力,为应对我国可能发生的WNV的传入和流行提供技术储备,有助于WNV感染的早期快速检测。2.含氯化学消毒剂和热灭活对CV-A6病毒的灭活与时间、有效氯浓度和温度有关,两种实验室常用的消毒剂在推荐的有效浓度下与热力消毒65℃ 30分钟和72℃ 10分钟的消毒效果相当都可以完全灭活病毒,可以作为肠道实验室对该病毒的常规灭活条件。