克氏原螯虾（Procambarus clarkii）,俗称小龙虾,是我国淡水养殖中最具经济价值的虾类之一。然而,随着养殖密度增加和养殖环境的恶化,克氏原螯虾病害频发,严重制约了其养殖业健康发展。因此,克氏原螯虾致病病原的鉴定和诊断及天然免疫防病的分子机制亟需开展研究,以此为病害防控提供理论指导。本课题组对本地患病螯虾进行了病原分离、鉴定、免疫相关基因生物学功能等研究,具体结果如下:1.克氏原螯虾病原的分离、鉴定以及病理学研究2019年5月,新乡市某养殖场的克氏原螯虾出现黑鳃、厌食、虾壳变软、肝胰腺肿胀及部分螯虾头胸甲有白斑的症状,并出现大量死亡的现象。从患病虾鳃中分离到1株优势菌LY-1,分子生物学等实验显示该菌为维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）。进一步研究发现该菌携带hly A、aer A、act和alt等4种毒力基因,对螯虾的半数致死量为3.02×10~7 CFU/m L,表明LY-1具有较强毒力。药敏试验显示LY-1对头孢噻肟等7种抗生素高度敏感。同时,采用PCR检测方法还从患病虾鳃中检测出白斑综合征病毒（WSSV）。人工回归感染发现A.veronii和WSSV混合感染组的螯虾发病症状及病理学变化与自然感染病虾症状相似,并且死亡率（100%）要高于单一病原感染组。综上,该养殖场患病克氏原螯虾为A.veronii和WSSV混合感染引起,实验结果可为克氏原螯虾的细菌和病毒混合感染的防控提供参考。2.克氏原螯虾感染维氏气单胞菌的免疫响应为研究克氏原螯虾对LY-1感染的免疫响应,本文研究了克氏原螯虾感染LY-1后体内血淋巴细胞总数（THC）、免疫酶活性和免疫相关基因表达变化。结果显示LY-1感染后,螯虾THC急剧减少。同时,血清中的酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、酚氧化酶（PO）和溶菌酶（LSZ）活性均高于对照组,但属于抗氧化酶的总超氧化物歧化酶（T-SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）酶活性低于对照组。A.veronii感染后,克氏原螯虾肠道、肝胰腺和鳃组织中8种免疫相关基因存在显著的转录激活和不同的表达变化。此外,Rab家族的Rab7基因m RNA表达量亦发生显著变化,推测其也参与了克氏原螯虾对LY-1的免疫响应。本实验结果可为理解和研究克氏原螯虾抗菌天然免疫应答反应提供理论基础。3.克氏原螯虾Rab7基因克隆、分子特征及免疫学功能研究本文克隆了克氏原螯虾Pc Rab7基因,以研究其结构特点、组织分布和对病原感染的免疫响应。Pc Rab7基因全长741 bp,包含一个468 bp的开放阅读框,编码155个氨基酸,预测蛋白分子量为17.61 k Da。Pc Rab7在健康螯虾肝胰腺、肠和血淋巴细胞等8个不同组织中均有表达,且在血淋巴细胞和肠中表达水平最高。A.veronii和WSSV刺激后,Pc Rab7在鳃、肠和肝胰腺中呈现显著的表达变化。本文构建了Rab7原核表达载体,并制备了鼠源多克隆抗体。结果显示,制备的抗体效价高达1:90,000,并可特异性识别原核表达的和内源性Rab7蛋白。本研究中成功克隆得到Pc Rab7的c DNA序列,可为研究Rab7蛋白的免疫学功能提供基础。4.克氏原螯虾Rab7异常表达对免疫学功能的影响为了弄清Rab7在克氏原螯虾中的免疫学功能,本研究设计了Rab7干扰基因和构建了真核表达载体,并进一步研究了Rab7干扰表达或过表达对血淋巴细胞吞噬功能和感染病原后死亡率的影响。结果显示,基因干扰后,受A.veronii感染的螯虾死亡进程明显加快,存活率为0%,而感染WSSV的螯虾发病进程有所减缓,并增加了螯虾的存活率。此外,Rab7受抑制后血淋巴细胞吞噬A.veronii的能力也显著降低。Rab7蛋白过表达后,A.veronii感染的螯虾死亡进程明显减缓（存活率为50%）,而WSSV感染后的螯虾发病进程明显加快（存活率为0%）,并显著增加了血淋巴细胞吞噬能力,吞噬效率增至49.8%。结果表明Rab7在血淋巴细胞吞噬中扮演重要作用,并参与抗病原感染的作用过程。