低分子量肝素(LMWHs)是一类常用的抗凝血药物，与未分级肝素(UFH)相比具有生物利用度高、抗凝血效应易预测及出血几率小等优点，因而逐渐取代了UFH而成为预防和治疗血栓栓塞类疾病的首选。依诺肝素钠是通过UFH在碱存在的条件下β-消除裂解得到，是应用最广泛、结构最复杂的一种LMWHs。自2010年美国FDA批准依诺肝素钠仿制药上市后，仿制药与专利药的化学和生物相似性的证明成为依诺肝素类药物生产和质量控制的难点。因此，LMWHs精细结构的分析方法和生物活性的测定方法成为了学术界和制药界研究的热点问题。　　肝素抗凝血活性主要依赖糖链中存在的一种特殊的五糖序列。这一五糖序列与抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)结合，使ATⅢ活性提高1000倍，从而达到抗凝血的作用。因此，肝素五糖的含量与肝素的抗凝活性大小具有直接相关性。肝素五糖序列的化学结构中的硫酸化位点和硫酸化程度均相对固定，两者的任何变化都有可能降低其活性。因此，分析肝素样品的五糖序列和硫酸化程度对于研究肝素的结构与活性的关系，以及在生产和储存肝素类药物的过程中的质量监测将起到非常重要的作用。本论文主要围绕这一问题展开。　　论文第一部分比较全面地总结了近年来在肝素结构与功能的研究方面的进展，并进行了详细的评述。　　第二部分，建立了一个肝素类药物抗凝血活性的自动化的测试方法。这一方法是将毛细管电泳柱上酶反应器与胶束电动色谱(MEKC)结合，用于测定依诺肝素钠抗对凝血因子Xa(FXa)活性的影响。以毛细管柱头作为微量的酶反应器，将依诺肝素钠、ATⅢ、FXa和发色底物的溶液依次进样、混合并孵育，然后直接用部分填充技术的MEKC模式对柱上酶反应产物进行分离分析。柱上酶反应器使样品和试剂的消耗量降低至nL级。而MEKC法能够将酶反应产生的对硝基苯胺(pNA)与样品中其它成分分离后检测，因此可在pNA的最大吸收波长380 nm下检测。通过生物检定统计法中的量反应平行线测定法进行统计学分析，方法的可靠性检测均达到要求。这一方法能够简单高效自动化的测定低分子量肝素的效价，可用于低分子量肝素生产、临床应用过程中的质量控制和治疗效果监测。　　目前，肝素抗凝血活性的测定方法往往是基于生化的半定量、间接的测试方法，而直接测定五糖序列的含量就可以精确测定肝素的活性，实现更为精确的质量控制。　　在论文第三部分，使用多维色谱分离和多维检测技术发展了一种依诺肝素钠中五糖序列定性定量的方法。在这个方法中，首先采用ATⅢ亲和色谱将依诺肝素钠按亲和力大小，分为高、中、低三个组分。然后，一方面利用毛细管电泳(CE)定量分析依诺肝素钠及其不同亲和组分的完全酶解产物，发现了不同亲和组分具有不同的硫酸化模式。通过对比相应的电泳图，鉴定了肝素五糖序列的降解寡糖峰，进而成功测定肝素五糖序列的含量，简单直接地反映依诺肝素钠样品的活性，与核磁的方法相比，这种方法操作简单且易在常规实验室中普及。另一方面，利用超高效液相色谱体积排阻色谱法/电喷雾四级杆飞行时间质谱(UPSEC/Q-TOF-MS)的方法分析不同亲和组分的寡糖谱，发现依诺肝素钠的亲和力具有分子量依赖性，亲和力越高的组分较长糖链的相对含量越高。另外，不同亲和组分的硫酸化程度也不同，亲和力高的组分硫酸化程度相对较高，但硫酸化程度过高反而会降低其亲和力。　　第四部分，在生产和长期储存过程中，肝素糖链上的磺酸基团易解离为游离硫酸根，在获取肝素原料及生产过程中还会引入其他阴离子如氯离子、乙酸根等，为了确保肝素类药物的纯度和稳定性，对这些离子的监测是非常必要的。发展了邻苯二甲酸作为背景电解质的毛细管电泳-间接紫外吸收法测定LMWHs中无机阴离子的含量。邻苯二甲酸具有较高的表观摩尔吸光系数(4754L·mol-1·cm-1)，而且电泳淌度与待分析的阴离子的电泳淌度均较匹配，检测灵敏度可达10-2 ppm，与离子色谱相当，且该方法具有较好的重复性（日内和日间的峰面积和迁移时间的RSD均小于3.0％）和准确性（回收率在95～118％范围内）。利用这个方法，测定了依诺肝素钠中阴离子的含量，并进行了样品的稳定性试验。试验证明了游离硫酸根的含量变化与其稳定性直接相关。　　在第五部分，又发展了硝酸根体系来测定肝素和依诺肝素钠中游离硫酸根的含量，这一方法进一步缩短了分析时间（3 min以内），且具有较好的重复性（日内和日间的峰面积和迁移时间的RSD均小于2.0％）和准确性（回收率在80.0～104.2％范围内）。　　这两种方法均可成功应用于肝素及肝素类似物中游离硫酸根的测定，有望应用于肝素类药物的生产和储存过程中的质量监测和药物环境指导。