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背景:非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是一种以肝细胞内脂肪过度蓄积为主要特征的病理综合征。随着我国国民经济的发展,NAFLD已成为我国最主要的慢性肝病,给我国国民健康带来了严重威胁。目前NAFLD病理机制虽未完全探明,但内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ERs）被认为是参与NAFLD疾病发展与演变的重要机制,近年来得到研究者的关注。由于NAFLD分子机制极为复杂,目前尚无特效的治疗药物。中医药对该病的研究却有悠久历史,且中药复方治疗NAFLD疗效显著。但是如何去解释中药复方治疗NAFLD的科学内涵是横亘在中医药科研工作者面前的一项挑战。因此,基于内质网应激探讨脂肝合剂治疗NAFLD的药理作用机制对于推广脂肝合剂的临床应用具有一定的现实意义。目的:该实验首先基于脂肝合剂潜在活性成分筛选及药效靶点预测,对脂肝合剂治疗NAFLD的药理作用机制进行生物信息学探讨,以明确脂肝合剂治疗NAFLD的临床疗效是否与其恢复肝细胞内质网功能稳态相关。然后,基于网络药理学的结果,对脂肝合剂治疗NAFLD的药理作用机制进行分子生物学探讨,以明确脂肝合剂治疗NAFLD的临床疗效是否与减轻肝细胞内质网应激、抑制NLRP3炎症小体活化相关。方法:1.靶点预测及网络构建:在TCMSP平台中完成脂肝合剂潜在活性成分的筛选后,将对应文件导入Swiss、SuperPred、Stitch数据库中进行靶点预测,后去除重合靶点,进一步整理得到活性成分相关的靶点信息。选取“Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD”为关键词在OMIM、TTD、GAD、Pharm Gkb数据库进行疾病靶点的检索及预测。最后,将活性成分相关靶点与疾病靶点进行对比分析,得交互靶标。将交互靶标导入至String数据库中,限定物种为人,获得靶点蛋白相互作用网络。利用Cytoscape3.4.0软件的关联功能构建单味药-活性成分-作用靶点网络模型,再利用Network Analyzer 功能获得的度（Degree）和中介度（Betweenness Centrality）等参数对模型进行分析。2.GO基因富集分析:将上述交互靶点输入到DAVID 6.8数据库中,进行GO生物功能富集分析。3.KEGG信号通路富集分析:利用DAVID 6.8数据库对作用靶点进行KEGG代谢通路富集分析。将基因物种和背景限定为人,选择Pathways下的KEGGPATHWAY,并设定P＜0.05,得富集结果,再通过OmicShare平台进行可视化处理。4.NAFLD小鼠模型的构建:利用雄性C57BL/6J小鼠喂养D12492高脂饲料12周以构建NAFLD体内模型。5.分组及干预:将雄性C57BL/6J小鼠按照随机数字表的方法随机分为对照组（n=10）、HFD模型组（n=10）、脂肝合剂低剂量组（n=10）、高剂量组（n=10）、阿托伐他汀组（n=10）5组,每组间体重无明显差异（P＞0.05）。对照组给予SPF级普通维持饲料自由进食,其余四组均给予D12492高脂饲料自由进食。D12492喂养12周后,开始按分组给予对应药物灌胃治疗。6.检测指标:（1）利用D12492高脂饲料喂养构建NAFLD体内模型,在此基础上利用OGTT、ITT评价脂肝合剂对高脂饮食诱导的NAFLD小鼠模型外周胰岛素抵抗的改善;（2）利用体重动态检测、脂肪类型测定等方法评估脂肝合剂对高脂饮食诱导的NAFLD小鼠模型代谢紊乱症状的改善;（3）利用油红O染色评估脂肝合剂对NAFLD小鼠模型肝内脂肪沉积的影响;（4）利用HE染色评估脂肝合剂对NAFLD小鼠模型肝内脂毒性组织损伤的改善;（5）测定各组动物血脂四项TC、TG、LDL-C、HDL-C水平,以评价脂肝合剂对NAFLD小鼠模型血脂水平的影响;（6）测定各组动物肝功能ALT、AST活力,以评价肝功能损伤情况;（7）运用实时荧光定量PCR测定 NAFLD 小鼠模型肝组织 ChREBP-1c、SREBP-1c、PPARα、PPARγmRNA 水平,以评价脂肝合剂对高脂饮食诱导的NAFLD小鼠模型脂肪代谢相关基因的调控;（8）利用Western blot免疫印迹检测ER stress/NLRP3级联相关蛋白的表达水平;（9）利用免疫荧光方法观察NAFLD小鼠模型肝组织PERK自磷酸化水平及下游NLRP3炎症小体的组装活化,以评估脂肝合剂治疗NAFLD的显著临床疗效是否与恢复肝细胞内质网功能稳态、抑制NLRP3炎症小体活化相关。结果:1.脂肝合剂与NAFLD之间存在146个交互靶标。涉及的基因主要包括细胞内胰岛素及糖脂代谢的调控、刺激信号及营养变化的适应性变化、DNA损伤的修复、炎症因子表达等方面,而串联这些功能的核心细胞器即为内质网。PPI结果提示我们脂肝合剂治疗NAFLD的作用机制可能与内质网应激的改善有关。2.GO基因富集分析显示交互靶标中涉及360个生物过程（占比55%,主要涉及营养、氧化应激、免疫炎症方面）;涉及细胞组分138个（占比22%,提示场所主要位于胆固醇及磷脂组成的膜筏、膜微结构域及穿膜区）;涉及分子功能152个（占比23%,主要涉及DNA转录因子活性、特异性RNA聚合酶Ⅱ活性调控在内的与内质网蛋白质折叠紧密相关的分子功能）。3.KEGG通路富集分析显示脂肝合剂与NAFLD的交互靶点显著富集于与内质网应激关系密切的晚期糖基化终末产物途径及血液剪切应力信号传导途径。此外,还涉及到内质网应激诱导的c-JUN、IL-1β、IL-6及Caspase3激活等一系列炎症因子表达。4.脂肝合剂对外周胰岛素抵抗的改善:在OGTT试验中,与HFD组相比脂肝合剂在各个时间点血糖水平均显著降低（P＜0.05）,且与低剂量组相比,脂肝合剂高剂量组在15min（P=0.009,P＜0.01）、30min（P=0.000,P＜0.001）、60min（P=0.001,P＜0.01）、90min（P=0.003,P＜0.01）血糖水平显著降低。结果该降糖作用具有一定剂量依赖性。在ITT试验中,与HFD组相比,脂肝合剂低剂量组在各时间点血糖下降百分比均显著升高。脂肝合剂高剂量组在15min、30min、60min、90min四个时间点（P＜0.01）血糖下降百分比均显著升高。5.脂肝合剂改善了 NAFLD小鼠的肥胖:在给药9周后,与HFD组相比,脂肝合剂低剂量组体重显著降低（P=0.01,P＜0.05）,脂肝合剂高剂量组体重显著降低（P=0.005,P＜0.01）,阿托伐他汀组显著降低（P=0.002,P＜0.01）。6.油红O显示脂肝合剂减轻NAFLD小鼠模型肝内脂肪沉积。7.HE染色显示脂肝合剂减轻NAFLD小鼠模型肝内组织损伤,恢复了肝小叶结构。8.与HFD组相比,脂肝合剂低、高剂量组及他汀组均显著降低了 TC,TG,LDL-C水平（P＜0.05）,并显著增高了 HDL-C水平（P＜0.001）。但在TG水平上他汀显示出了优于脂肝合剂的显著药效（P＜0.001）;在HDL-C、LDL-C水平上均显示出了优于脂肝合剂的药效（P＜0.05）。9.与HFD组相比,脂肝合剂低、高剂量组均显著改善了 ALT、AST水平（P＜0.001,P＜0.001）。他汀组与HFD组相比却未显示出对肝功能损伤的改善（P＞0.05,P＞0.05）;而与脂肝合剂组相比,脂肝合剂低、高剂量组均显示出优于他汀组的改善肝功药效,差异有统计学意义（P＜0.05,P＜0.05）。10.脂肝合剂高剂量组及他汀组均显著降低了 ChREBP-1c及SREBP-1c的mRNA水平（P＜0.05,P＜0.05）,显著增强了 PPARα 的 mRNA 水平（P＜0.05,P＜0.05）。11.与HFD组相比,脂肝合剂给药显著升高了 PDI的表达:低剂量组（P＜0.05）,高剂量组（P＜0.01）,他汀组（P＜0.05）;脂肝合剂给药显著降低了 BIP的表达:低剂量组（P＜0.01）,高剂量组（P＜0.001）,他汀组（P＜0.001）;脂肝合剂给药显著降低CHOP的表达:低剂量组（P＜0.001）,高剂量组（P＜0.001）,他汀组（P＜0.001）;脂肝合剂给药显著抑制了 PERK的自磷酸化表达:低剂量组（P＜0.01）,高剂量组（P＜0.001）,他汀组（P＜0.001）。12.与HFD组相比,脂肝合剂给药显著抑制了 NLRP3的表达:低剂量组（P＜0.001）,高剂量组（P＜0.001）,他汀组（P＜0.001）;脂肝合剂给药降低了 ASC的表达,但无统计学意义:低剂量组（P=0.331,P＞0.05）,高剂量组（P=0.158,P＞0.05）,他汀组（P=0.148,P＞0.05）;脂肝合剂给药显著降低Caspase1切割:低剂量组（P＞0.05）,高剂量组（P＜0.05）,他汀组（P＜0.01）;脂肝合剂给药显著抑制了 IL-1β成熟体表达:低剂量组（P＜0.01）,高剂量组（P＜0.01）,他汀组（P＜0.01）。结论:1.由于脂肝合剂潜在活性成分与NAFLD间存在深刻交互,因此脂肝合剂治疗NAFLD具有多靶点、多层次、多途径的协同药效,且该药效与脂肝合剂改善内质网功能稳态有关。2.脂肝合剂显著改善NAFLD小鼠的代谢紊乱及肝内脂毒性损伤,且其机制可能与通过抑制P-PERK/NLRP3/IL-1β通路改善NAFLD小鼠肝组织ER stress/NLRP3病理级联有关。