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目的:分析不同时期慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）患者肾组织中发生程序性坏死的肾小管上皮细胞数量及其与临床病理指标的相关性,探讨CKD患者肾小管上皮细胞程序性坏死,在慢性肾损伤不断进展中的作用。同时,为了进一步了解CKD患者肾损伤发生的程序性坏死的触发因素,本实验通过体外实验证实AngⅡ在体外可诱导肾小管上皮细胞发生程序性坏死,并探讨其可能的机制。方法:收集2017年6月至2019年6月于海南医学院第一附属医院行肾活检且估算肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate,e GFR）≥15 ml·min-1·（1.73m2）-1的CKD患者的临床病理资料和肾组织活检标本。按照改善全球肾脏病预后组织（Kidney Disease:Improving Global Outcomes,K/DOQI）指南分为CKD1-4期,每期20名患者。HE染色和PASM染色方法观察各期患者肾组织病理变化及肾脏纤维化程度。用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末记法（d UTP nick-end-labeling,TUNEL）+受体相关蛋白3（Receptor interacting protein3,RIP3）免疫荧光、免疫组化技术分别检测不同时期CKD患者肾组织中发生程序性坏死的肾小管上皮细胞数和程序性坏死标志性蛋白RIP3、MLKL的表达,以及不同时期CKD患者肾脏局部的血管紧张II 1型受体（Angiotensin II type 1receptor,AT1R）、血管紧张II2型受体（Angiotensin II type 2 receptor,AT2R）蛋白的表达,并比较其差异。采用Spearman相关性检验分析肾组织中肾小管上皮细胞程序性坏死率与临床病理指标、AT1R和AT2R表达率的相关性。分别用正常培养基及含10-10-10-5M不同浓度的Ang II处理HK-2细胞,24小时收集细胞,用用含有10-9M浓度Ang II的DMEM/F12完全培养基培养HK-2细胞,分别在12、24、36、48、72h小时收集标本,并将细胞分组为:正常对照组、Ang II组、Ang II+Nec-1（Necrostatin-1）组、Ang II+GSK’872（N-5-benzothiazolyl-6-[（1-methylethyl）sulfonyl]-4-Quinolinamine）组、Ang II+NSA（Necrosulfonamide）组,采用流式细胞仪检测坏死的人肾细胞（HK-2,永生化的人近端肾小管上皮细胞系）;通过电镜观察细胞形态学和TUNEL染色观察Nec-1、GSK’872、NSA对肾小管上皮细胞的影响;用Western blot检测不同组别RIP1、RIP3、混合系列蛋白激酶样结构域（Mixed lineage kinase domain-like,MLKL）蛋白及其磷酸化蛋白表达变化。最后收集整理数据,分析CKD患者肾小管上皮细胞是否发生程序性坏死,及Ang II是不是肾小管细胞坏死的有效介体。结果:在CKD患者（肾活检患者）的一般临床资料中,按照对照组、CKD1期、CKD2期、CKD3期、CKD4期顺序,CKD患者e GFR逐渐下降,与对照组有显著性差异（P<0.01）;患者在年龄、血肌酐（serum creatinine,Scr）、血尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）、血尿酸（Serum uric acid,SUA）、胱抑素c（Cystatin C,Cys）、24h尿蛋白定量、收缩压水平逐渐升高,CKD2期、3期、4期均与对照组有显著差异（P<0.01）;按照K/DOQI指南进行CKD分期比较HE染色和PASM染色结果显示,随着CKD进展,CKD患者肾小管的结构破坏逐渐加重,相应区域的肾小管萎缩,伴间质纤维化的不断加重;相邻区域肾小管灶性扩张、小管内可见大量蛋白管形,CKD2,3期患者肾小管损伤分数较对照组明显增高（P<0.01）,在CKD4期有所下降;肾间质纤维化程度逐渐加重;TUNEL+免疫荧光染色结果显示,CKD2,3期患者肾小管上皮细胞TUNEL+/RIP3+双阳性肾小管上皮细胞（程序性坏死细胞）百分率明显增高（P<0.01）。免疫组化结果显示,CKD患者肾组织RIP3、MLKL和AT2R蛋白主要表达于肾小管上皮细胞胞浆内,在CKD2,3期患者肾小管上皮细胞胞浆表达明显增高（P<0.01）,而AT1R蛋白表达结果无显著差异（P>0.05）。Spearman相关分析结果显示,肾小管上皮细胞程序性坏死率与尿素氮、血肌酐、胱抑素C、血尿酸和肾小管损伤分数、肾间质纤维化指数及AT2R呈正相关（P<0.05）,BUN r=0.640,Scr r=0.561,Cys r=0.828,SUA r=0.695,肾小管损伤评分数r=0.901,肾间质纤维化指数r=0.700;而e GFR r=-0.557,呈负相关（P<0.05）。用10-10-10-5M不同浓度Ang II诱导HK-2细胞,应用流式细胞仪测定24小时的坏死率,结果显示:与正常对照组相比,10-9M浓度Ang II诱导组坏死率显著增高;用10-9M浓度的Ang II诱导HK-2,分别在12、24、36、48、72h小时收集标本,用流式细胞仪检测HK-2细胞坏死率,结果显示:与正常对照组相比,24小时组HK-2细胞的坏死率显著增高,有显著性差异（P<0.01）;电镜下观察HK-2细胞形态学的变化发现:在10-9M Ang II组诱导HK-2细胞呈明显的坏死形态学特征,在Ang II+Nec-1组、Ang II+GSK’872和Ang II+NSA组部分细胞空泡样变性,且发生坏死的细胞百分率较Ang I I组显著降低;应用程序性坏死特异性蛋白RIP3和TUNEL荧光共染评估肾小管上皮细胞程序性死亡情况,结果发现:与control组相比,Ang II+vehicle组的TUNEL+RIP3阳性细胞百分率明显升高,与Ang II+vehicle组比较,Nec-1、GSK’872、NSA可以明显降低TUNEL+/RIP3+双阳性细胞的百分率（P<0.01）。应用western blot检测程序性坏死关键蛋白RIP1、RIP3、MLKL蛋白及其磷酸化蛋白表达。结果显示:与对照相比,Ang II组的RIP1、RIP3、MLKL蛋白及其磷酸化蛋白表达明显增高,有显著差异（P<0.01）。Nec-1能有效抑制RIP1、RIP3、MLKL蛋白及其磷酸化蛋白表达。GSK’872可以抑制RIP3、MLKL蛋白及其磷酸化蛋白表达影响。NSA能有效降低MLKL和P-MLKL蛋白的表达（P<0.01）。结论:在CKD进展中,CKD患者肾小管上皮细胞的确发生程序性坏死,该程序性坏死可能在肾损伤进展中发挥了重要作用,并且Ang II的细胞毒性可在体外触发肾小管上皮细胞的程序性坏死,Nec-1、GSK’872、NSA阻滞剂可有阻断程序性坏死发生的作用。