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目的:探讨YAP(Yes-associated protein)基因与甲状腺乳头状癌(papillarythyroid carcinoma,PTC)发生发展的关系及其生物学意义,探讨甲状腺乳头状癌中P14ARF基因启动子甲基化及蛋白的表达及意义,分析YAP基因和P14基因在甲状腺乳头状癌中表达的相关性。
材料与方法:
1.材料:选自台州学院附属台州市立医院肿瘤外科2011年2月至2011年9月期间的手术切除组织标本共40例。其中实验组甲状腺乳头状癌20例,男性6例,女性14例,年龄23-65岁,平均45.3岁,根据患者年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移情况分成亚组,其中肿瘤组中年龄≥45岁15例,<45岁5例;肿瘤直径>2cm的11例,肿瘤直径≤2cm的9例;伴淋巴结转移4例,无淋巴结转移16例;对照组为随机选取的结节性甲状腺肿手术标本中相对正常的组织,男性9例,女性11例,年龄26-57岁,平均40.2岁。标本体积约5×5mm大小,其中1/2于20 min内置于-80℃冰箱中保存,用于甲基化特异性PCR、实时定量PCR及Western blot检测;另1/2置于10%福尔马林溶液中固定,用于免疫组织化学检测。所有标本均经病理证实,且经病患同意;所有病例术前均未行放疗或者化疗。
2.方法:
2.1QRT-PCR(实时定量PCR):检测YAP基因mRNA在甲状腺乳头状癌及对照组间的表达情况;检测P14ARFmRNA在甲状腺癌组织、对照组中的表达情况,组间采用t检验,P<0.05认为差异有统计学意义。
2.2 Western blot(蛋白质杂交):检测甲状腺乳头状癌组织及对照组中YAP蛋白表达情况并进行对比分析,组间采用t检验,P<0.05认为差异有统计学意义。
2.3 Immunohistochemistry(免疫组织化学,IHC):检测甲状腺乳头状癌组织及对照组中YAP蛋白表达情况,并检测甲状腺乳头状癌组织、对照组中P14ARF蛋白表达情况,组间计数资料比较采用卡方检验,P<0.05认为差异有统计学意义。
2.4 MSP(甲基化特异性PCR):检测P14ARF基因启动子在甲状腺乳头状癌和对照组中的甲基化情况,组间计数资料比较采用卡方检验,P<0.05认为差异有统计学意义。
结果:
1.Real-time PCR:甲状腺乳头状癌组织较对照组中YAPmRNA表达降低,甲状腺乳头状癌组织较对照组中P14mRNA表达降低。并且具有统计学意义(P<0.05)。
2.Western blot:检测YAP蛋白在甲状腺癌中较对照组中表达降低,并且具有统计学意义(P<0.05)。但不同年龄、不同性别、有无淋巴结转移等组间差别无统计学意义(P>0.05)
3.IHC: YAP蛋白在对照组中表达均呈强阳性,甲状腺乳头状癌组织中呈弱阳性,P14ARF蛋白在对照组中表达均呈强阳性,甲状腺乳头状癌组织中呈弱阳性。并且具有统计学意义(P<0.05)。
4.MSP:甲状腺乳头状癌组织中P14ARF基因启动子区5-CpG岛甲基化发生率明显高于对照组。并且具有统计学意义(P<0.05)。
结论:
1.在甲状腺乳头状癌组织中,YAP在mRNA及蛋白质表达水平均出现明显降低。 YAP甲状腺乳头状癌中为抑癌基因。
2.在甲状腺乳头状癌组织中,P14ARF在mRNA及蛋白质表达水平均出现明显降低,P14ARF在甲状腺乳头状癌中为抑癌基因。P14ARF表达的下调和甲状腺乳头状癌组织中P14ARF基因启动子区5-CpG岛高甲基化有关。
3.甲状腺乳头状癌中YAP和P14ARF在基因和蛋白水平均出现下调。两者在甲状腺乳头状癌中的表达同向变化,提示该蛋白及其通路存在可能的相互调节机制。