第1章引言在过去的几十年里,慢性肝脏疾病已成为全球重大的健康和经济负担之一。目前,全球有约8.44亿人罹患肝病,每年有近200万名患者死于肝病,约占全世界所有死亡率人数的4%。终末期肝病是各种慢性肝病的终末期阶段,由肝脏的炎性变化导致纤维化及肝脏结构和功能破坏后发展而来。肝移植被认为是治疗终末期肝病的首选治疗方案,也是唯一被证实具有长期临床益处的治疗措施。然而供体肝脏的数量不足以满足日益增长的临床需求,每年仍然有约10%的患者在等待肝源的过程中死亡。基于强大的复制潜能,肝细胞移植被认为是肝移植的一种有效的替代治疗方案。尤其是在代谢性疾病的背景下,移植的细胞一旦植入受体肝脏中,就能修复受损的肝功能。然而,肝细胞具有明显的异质性,根据其代谢功能的差异,肝细胞可分为门静脉周围区、中央静脉周围区和小叶中间区三个区域。不同区域的肝细胞除了代谢功能不同,他们在肝稳态或不同肝损伤模型中的增殖能力亦不同。中央静脉区周围的Axin2+和Lgr5+肝细胞,门静脉周围的Mfsd2a+、Hnf4α+Hnf1β+CK19-和Hnf4α+AFP+Ep CAM+肝细胞以及散在分布于肝小叶的TERTHigh肝细胞,均被认为在稳态和/或某些肝损伤条件下承担着肝再生的主要任务。目前,关于肝脏再生过程中肝细胞的来源问题一直存在着较大的争议。但主流的观点认为无论在肝小叶内的位置如何,肝细胞都具有同等的再生增殖能力。然而,作为肝移植的替代治疗或过渡治疗,在肝细胞移植后细胞增殖促进肝脏再生的过程中,新生肝细胞的来源以及供体肝细胞增殖并重新填充病变宿主肝脏的细胞机制尚不清楚。为能够深入研究供体肝细胞及其子代细胞在肝细胞移植后的命运,我们拟通过谱系示踪和单细胞RNA测序的方法对肝细胞移植后的增殖过程进行分析。第2章Cre-loxp系统在肝细胞示踪中的应用目的:通过病毒感染的方式对肝细胞进行荧光标记,并检测其安全性、有效性和特异性。方法:通过对Rosa26-LSL-td Tomato小鼠尾静脉注射AAV-TBG-Cre病毒载体可对肝细胞进行荧光标记。病毒感染后的第3天对小鼠血清学肝脏功能指标（ALB、ALT、AST和TBIL）进行检测。第7天取肝脏组织进行H＆E染色观察小鼠肝脏组织结构。通过细胞免疫荧光、流式分选、冰冻切片和免疫组织化学对荧光标记的有效性进行检测。通过小动物活体成像系统和免疫组织化学对荧光标记的组织特异性进行检测。结果:我们通过病毒感染的方式成功的完成了肝细胞的荧光标记。病毒载体组和PBS对照组小鼠血清学肝功能指标之间无明显的统计学差异（P＞0.05）。H＆E染色检查结果显示两组小鼠肝脏组织结构清晰,无紊乱和坏死。肉眼观,病毒载体感染的小鼠肝脏整体呈现出砖红色,而PBS对照组肝脏则呈淡黄色。流式分选可从病毒载体组可获取约74%的td Tomato+肝细胞,而对照组未收集到td Tomato+肝细胞。细胞免疫荧光证实,自发td Tomato荧光与免疫染色荧光完全重叠。肝脏组织冰冻切片和免疫组织化学染色显示,几乎所有的肝细胞均呈现出td Tomato阳性。IVIS和免疫组织化学染色对小鼠的组织器官检查发现,仅病毒感染的小鼠肝脏中检测到td Tomato的表达。结论:AAV8-TBG-Cre病毒载体对Rosa26-LSL-td Tomato小鼠肝细胞的荧光标记具有安全性、高效性和特异性。第3章肝细胞移植挽救肝衰竭模型小鼠肝功能目的:建立肝功能衰竭小鼠模型,并验证肝细胞移植对肝衰竭模型小鼠肝功能的救治能力。方法:通过Fah基因缺陷（Fah-/-）小鼠构建肝功能衰竭模型,血清学检测肝衰模型小鼠的肝功能指标。H＆E染色对肝衰模型小鼠肝脏组织结构的破坏程度进行检查。肝细胞移植后,通过H＆E染色、免疫组织化学染色和血清学检查对肝细胞移植后的肝功能衰竭的拯救效果进行评估。另外,通过体重曲线和生存曲线对小鼠的生存状态进行分析。结果:通过撤除Fah-/-小鼠饮水中的NTBC药物,小鼠血清ALB水平降低,ALT、AST和TBIL水平升高。肝组织H＆E染色发现,停药后肝脏原有的组织结构被破坏,出现空泡样细胞和细胞死亡。肝细胞移植后3周、6周、9周和12周受体肝脏样本FAH蛋白免疫组织化学染色结果显示,供体细胞在宿主肝脏内成功定植,且随着定植时间增加,FAH阳性面积比例增加。血清学检查发现,随着再殖时间的增加,小鼠血清ALB水平逐渐升高,ALT、AST和TBIL水平逐渐降低,提示肝功能的改善。体重数据显示,在接受肝细胞移植后的前3~4周小鼠体重呈逐步下降趋势,4周之后体重逐步上升并恢复至初始体重水平。生存曲线数据提示,肝细胞移植组小鼠存活率明显高于对照组（P＜0.05）。结论:移植的肝细胞可有效的植入Fah-/-肝衰竭模型小鼠的肝脏,进而改善小鼠肝脏功能,维持小鼠长期存活。第4章单细胞RNA测序分析体内增殖肝细胞异质性目的:单细胞RNA测序分析肝细胞体内连续增殖后细胞异质性和转录谱的变化规律。方法:根据实验设计流程通过胶原酶灌注和流式分选的方式制备单细胞测序样本;通过Singleron Matrix?单细胞处理系统进行细胞分离、细胞裂解和m RNA捕获;通过EXSCOPE?单细胞RNA文库试剂盒进行单细胞转录组扩增和文库制备;毛细管电泳实验对c DNA文库和测序文库进行质检;使用Cele Scope单细胞软件将测序数据转化为细胞表达矩阵;Seurat R软件包进行预处理和归一化处理;对不同移植轮次和再植时间样本数据进行PCA降维分析、UMAP聚类分析、差异表达分析和拟时序分析。结果:所有单细胞测序样本中细胞活性均在80%以上,单细胞率均在90%以上,均符合测序要求。毛细管电泳实验检测结果显示c DNA文库及测序文库质量均符合二代测序的标准。经数据筛选后,6个样本共获得了约5.6×104个细胞,平均每个细胞测到的reads数为4.8×104,平均UMI为1.1×104,每个样本检测的基因数平均为2.1×104,每个细胞基因检测数平均为1500个,样本的平均饱和度为56%。PCA降维分析和UMAP聚类分析结果显示第1轮肝细胞移植样本分别可分为11、13、11个细胞cluster,第二轮移植的样本中肝细胞分别聚类15、12、12个细胞cluster。在不同移植轮次和再殖时间点均有发现表达某些特异性基因的细胞亚群。表达巨噬细胞相关的Saa家族基因的细胞亚群,表达细胞周期和细胞有丝分裂相关的Ube2c和Stmn1基因的细胞亚群,表达细胞增殖和分化相关的Tmsb4x基因的细胞亚群,表达肝干细胞相关基因AFP的细胞亚群和表达肝细胞色素P450相关基因的细胞亚群等。差异基因表达热图也证实各个细胞亚群在转录谱上的表达具有差异。Monocle2对肝细胞cluster进行了拟时序分析,不同时间点样本都有两条轨迹鲜明的进化分支,证明各个细胞亚群之间可能存在发育上的差别。结论:肝细胞具有明显的异质性,而且随着细胞的移植,细胞的异质性发生变化。第5章AFP阳性肝细胞在体内连续增殖过程中的作用目的:单细胞RNA测序数据整合分析移植肝细胞体内连续增殖过程的规律。方法:将单细胞测序样本数据进行整合分析,并筛选出td Tomato阳性的肝细胞。首先通过Beer算法去除样本的批次效应,然后再通过UMAP算法对综合数据集进行降维。GSVA富集分析比较各细胞样本肝细胞肝系指数。UMAP算法对细胞亚群进行聚类分析其空间位置。SLICE算法对单细胞熵值进行计算。GSVA富集分析和非负矩阵分解算法对细胞的共表达模式进行分析。RNA速率分析预测细胞状态及分化倾向。组织双重免疫荧光染色对再殖AFP+细胞进行检测。用Scenic算法对特殊细胞亚群的转录调控网络进行分析。结果:各样本中td Tomato+细胞的占比从72.68%到99.7%不等,其中原代肝细胞中td Tomato+细胞占比最高,再殖3周的肝细胞中td Tomato+细胞占比最低。GSVA分析对各样本的肝系指数进行计算发现,再殖3周的肝细胞肝系指数低于其他时间点样本。UMAP聚类可视化结果显示,来自不同再殖时间点的40546个td Tomato+肝细胞可聚类为16个cluster亚群。其中,再殖3周的肝细胞以cluster6、cluster 8、cluster 11和cluster 12亚群为主。对细胞周期进行评分发现,cluster6中大部分细胞处于细胞周期外,其他cluster处于各个细胞周期的比例基本相近。再增殖基因表达的图中,cluster 6中的增殖相关基因表达最高。通过聚类分析发现肝细胞存在明显的zonation分区特异性,但在增殖最活跃阶段,分区特性变得模糊。SLICE算法对sc Entropy值进行计算发现,3周样本熵值最高,这与其表达肝干细胞标记相一致。GSVA富集分析和NMF算法均将16个cluster亚群细胞聚类为5个program,而且表达program的细胞主要来自于早期再殖样本。UMAP聚类发现AFP+肝细胞群分布与progrom3表达分布高度重合。RNA速率分析分析提示AFP+肝细胞群在细胞增殖过程中起关键枢纽作用。双重免疫荧光染色证实了再殖肝细胞中AFP+细胞的存在。转录因子调控网络分析,E2f4、Ybx1、Atf3、Pole4和Bcl3等转录因子参与AFP+肝细胞的转录调控。其中转录因子E2f4的调控作用可能最大。结论:肝细胞在连续体内增殖过程中会产生AFP+肝细胞群体,而该细胞群体可能在肝细胞移植后的再殖过程中起关键主导作用。