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目的:非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）是最常见的恶性肿瘤之一,部分患者就诊时已处于肿瘤晚期,失去手术机会,新辅助治疗被用于缩小局部晚期肿瘤的体积或降期,以重新获得根治性手术的机会,但以铂类为基础的单化疗效果有限。目前,免疫治疗尤其是免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint inhibitors,ICIs）单药或联合化疗已成为晚期NSCLC重要治疗策略之一。新辅助ICIs联合化疗在NSCLC中的应用也备受关注,许多临床研究已经证实新辅助ICIs联合化疗在早期可切除NSCLC中取得了良好的病理缓解率和持久的临床获益,但肿瘤消退的免疫机制和反应的生物标志物尚未完全阐明。方法:为了确定与新辅助ICIs联合化疗临床疗效相关的免疫因素,我们收集了4例未接受新辅助治疗直接手术切除以及8例接受2周期新辅助派姆单抗联合化疗后手术切除的ⅢA期NSCLC患者的新鲜肿瘤组织（T）以及五个相关样本,包括邻近的癌旁组织（N）,局部引流淋巴结（LN）、远端正常肺组织（D）以及新辅助治疗前（P0）和治疗后外周血（P1）,将新鲜组织解离成单细胞悬液,利用美天旎CD45 Micro Beads磁珠分选CD45+免疫细胞后采用10x Genomics技术进行单细胞RNA-seq和TCR-seq测序。通过多种生物信息学分析方法筛选单细胞测序数据中与疗效相关的免疫细胞因素,并通过流式细胞术、多色免疫荧光染色（Multiplex fluorescent immunohistochemistry,m IHC）、ELISA等方法在蛋白水平进行结果验证。最后,我们收集了26例未接受新辅助治疗直接手术切除的ⅢA期以及30例接受2周期新辅助派姆单抗联合化疗后手术切除的ⅢA/ⅢB期NSCLC患者的肿瘤组织,对CD4、IL-21、CD20、Ig G1、Ig G3、Ig A进行m IHC进一步验证这些指标作为预测新辅助ICIs联合化疗疗效生物标志物的可行性。结果:1.我们对每个测序样本捕获的细胞数量、单个细胞平均基因数、测序饱和度等参数进行质量评估,认为测序质量符合要求。样本整合后,我们共获得了186477个CD45+免疫细胞的单细胞转录组图谱,分为29个亚群,包括2个自然杀伤细胞/自然杀伤T细胞（Natural killer cells/Natural killer-like T cells,NK/NKT）亚群（C0-NK/NKT-GNLY/NKG7,C20-NK-XCL1）,3个CD4+T细胞亚群（C2-CD4-IL7R,C4-CD4-TCF7,C11-Treg-Fox P3）,6个CD8+T细胞亚群（C3-CD8-KLRG1,C5-CD8-IL7R,C7-CD8-PDCD1,C8-CD8-GZMK,C21-CD8-MKI67,C24-CD8-TCF7）,3个B细胞和浆细胞亚群（C6-B细胞-CD79A,C17-浆细胞-IGHG1,C22-B细胞-MS4A1）,9个髓系细胞亚群（C1-巨噬细胞-CD81,C9-髓源性抑制性细胞-S100A8/A9,C10-中性粒细胞-CXCL8,C15-巨噬细胞-CCL18,C16-树突状细胞-HLA II molecules,C18-肥大细胞-TPSAB1,C19-单核细胞-CD16,C25-浆细胞样树突状细胞-IL3RA,C26-巨核细胞-PPBP）,以及C23-内皮细胞-VWF,C27-上皮细胞-KRT17和处于细胞增殖状态的细胞亚群如C14和C28。2.新辅助派姆单抗联合化疗后肿瘤组织内淋巴细胞和髓系细胞发生了明显改变,淋巴细胞的比例显著增加,髓系细胞比例明显减少。新辅助派姆单抗联合化疗肿瘤组织中三级淋巴结构（Tertiary lymphoid strctures,TLSs）、B细胞、T滤泡辅助细胞（T follicular helper cells,Tfh）明显富集,Tfh分泌的IL-21促使B细胞向Ig G（主要是Ig G1和Ig G3）类别转换,并与治疗反应密切相关。3.细胞相似度分析发现免疫细胞在肿瘤组织和外周血之间迁移的可能性。TCR克隆型分析证实新辅助派姆单抗联合化疗促使局部组织内CD4+T细胞克隆的激活扩增和外周血CD8+T细胞克隆扩增,并促进外周血CD8+T细胞向肿瘤组织补充,从而改善肿瘤组织内CD8+T细胞的耗竭和功能失调状态。因此,治疗前外周血TCR多样性和CD8+T细胞的克隆扩增是新辅助派姆单抗联合化疗抗肿瘤T细胞反应的早期预测指标。4.新辅助派姆单抗联合化疗后肿瘤组织中TNFRSF4+调节性T细胞（Regulatory T cells,Tregs）的减少与良好的治疗反应密切相关,是新辅助派姆单抗联合化疗疗效的阳性预测因素。5.单细胞数据及流式检测证实LAMP3+DCs在新辅助治疗后肿瘤组织内富集,并与治疗反应密切相关。受体-配体分析显示LAMP3+DCs能够通过CCL22/CCR4、CCL17/CCR4轴和CCL19/CCR7轴与CD4+T细胞、CD8+T细胞和B细胞相互作用,参与淋巴细胞募集;LAMP3+DCs通过PD1/PD-L1和PD1/PD-L2信号通路对B细胞、Tregs、CD4+和CD8+T淋巴细胞具有调控作用,并通过CD226/NECTIN2和TIGIT/NECTIN2信号通路对NK/NKT细胞具有调控作用。6.验证队列样本m IHC证实肿瘤组织内CD20+B细胞,Ig G1、Ig G3、Ig A抗体亚型,CD4+T细胞和IL-21均与新辅助派姆单抗联合化疗疗效显著相关。此外,外周血血浆IL-21浓度与新辅助派姆单抗联合化疗应答反应密切相关。结论:新辅助派姆单抗联合化疗后,肿瘤组织内TLSs、B细胞和CD4+T细胞的协同增加是促使有效抗肿瘤免疫反应的主要因素。Tfh分泌的IL-21促进B细胞向Ig G（主要是Ig G1和Ig G3）类别转换,并与疗效密切相关,因此,我们推测Tfh分泌的IL-21促使B细胞向Ig G类别转换是新辅助派姆单抗联合化疗抗肿瘤免疫应答的关键作用机制。治疗前外周血TCR多样性是识别新辅助派姆单抗联合化疗临床反应的标志,监测外周血TCR多样性和CD8+T细胞克隆扩增有助于早期识别抗肿瘤免疫反应。肿瘤组织中TNFRSF4+Tregs细胞的减少与治疗反应呈正相关,是新辅助派姆单抗联合化疗疗效反应良好的阳性预测因子。LAMP3+DCs参与新辅助派姆单抗联合化疗过程中淋巴细胞的募集和调控,与肿瘤内丰富的淋巴细胞浸润以及对新辅助派姆单抗联合化疗的临床反应有关。此外,外周血血浆IL-21可作为预测和监测新辅助ICIs联合化疗疗效的潜在生物标志物,并可协助筛选更有可能从治疗获益的患者。总而言之,我们的免疫单细胞RNA-seq和TCR-seq景观研究为新辅助ICIs联合化疗过程中协同相互作用的细胞机制提供了新的见解,并提供了潜在的预测性生物标志物和治疗靶点,以进一步提高NSCLC新辅助ICIs联合化疗的疗效。