论文部分内容阅读
第一部分MicroRNA-34c/PI3K-Akt调控环路在Vaspin调控MC3T3-E1细胞成骨分化中的作用机制研究背景骨质疏松(osteoporosis, OP)是一种常见的疾病,它主要表现为骨量降低和骨细微结构破坏,严重者可导致骨折发生。根据流行病学统计,OP在我国人群中的发病率大约为13.2%,其治疗及预防费用给国家和社会带来了巨大的负担,因此研究骨质疏松的发病机制及影响因素具有非常重要的意义。脂肪因子是一类由脂肪细胞分泌的活性生物分子,包括脂联素、瘦素、网膜素等多个成员。研究发现多个脂肪因子在骨代谢调节中发挥着重要的作用,其中内脏脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂(Vaspin)是一种新近发现的脂肪因子,以往的研究发现它可以抑制人成骨细胞的凋亡,但是对于Vaspin在成骨分化过程中的作用尚未见报道。目的本实验旨在研究Vaspin对小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1细胞系成骨分化的影响,并观察miR-34c在此过程中的作用,从而探讨Vaspin调控成骨分化的具体机制。进一步,研究PI3K-Akt信号通路在此过程中的激活并讨论其与miR-34c之间的相互作用,有助于完整阐明Vaspin调控成骨分化的机制,为骨质疏松的预防和治疗提供新的靶点。方法1.分别使用不同浓度的Vaspin干预MC3T3-E1细胞72小时或联合p-甘油磷酸钠(p-GP)干预20天,通过对硝基苯酚法、western blot及放免法等方法检测成骨相关标志物的表达变化,以明确Vaspin对MC3T3-E1成骨分化的影响；2.通过microarray技术分析Vaspin干预前后MC3T3-E1microRNA(miRNA)表达谱的改变,筛选可能参与了此过程的miRNA;3.通过查阅成骨分化相关文献并结合第2步结果筛选可能参与了此过程的miRNA,通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)验证芯片结果；4.通过向MC3T3-E1内转染mimics或者inhibitor构建miRNA过表达或低表达模型,检测在这两种模型中Vaspin对成骨分化的影响,以进一步证实miRNA的表达变化是Vaspin调控MC3T3-E1成骨分化的可能机制；5.在前人研究的基础上对miRNA的靶基因进行预测,通过向MC3T3-E1内转染miRNA mimics或者inhibitor构建过表达或者低表达模型,检测靶基因mRNA及蛋白变化以证实猜测；6.采用western blot检测Vaspin干预MC3T3-E1各个时间点间磷酸化Akt (p-Akt)的表达变化来研究PI3K-Akt信号通路在Vaspin调控MC3T3-E1成骨分化中的变化；7.利用LY294002预处理细胞阻断PI3K-Akt信号通路后给予Vaspin干预,通过qRT-PCR检测miRNA表达,以研究PI3K-Akt信号通路在此过程中对miRNA表达的调控作用；8.利用PI3K-Akt阻断剂LY294002预处理细胞阻断PI3K-Akt信号通路,通过观察阻断后Vaspin对MC3T3-E1成骨相关标志物表达的影响,进一步明确PI3K-Akt信号通路在此过程中的作用；9.利用miRNA mimics或者inhibitor构建miRNA过表达或低表达模型,给予模型Vaspin干预,通过western bolt观察p-Akt蛋白表达情况以明确miRNA对PI3K-Akt信号通路的影响。结果1.MC3T3-E1经过不同浓度的Vaspin干预72小时后,与对照组相比,干预组Runx2蛋白的表达下降、ALP活性降低、OC分泌减少,且下降呈现剂量依赖效应。用100ng/ml的Vaspin干预β-GP诱导分化的MC3T3-E1田胞20天,矿化结节形成显著降低；2. Microarray分析结果提示我们在Vaspin抑制MC3T3-E1成骨分化的过程中mmu-miR-127, mmu-miR-34c, mmu-miR-214, mmu-miR-139, mmu-miR-6350, mmu-miR-30a, mmu-miR-146b, mmu-miR-483的表达上调,同时mmu-miR-210, mmu-miR-31, mmu-miR-6380, mmu-miR-126, mmu-miR-218-1, mmu-miR-720, mmu-miR-379, mmu-miR-2861表达下调。结合文献筛选miR-34c作为本实验的主要研究对象,qRT-PCR结果证实Vaspin干预MC3T3-E1细胞后,miR-34c表达水平明显升高；3.向MC3T3-E1内转染miR-34c inhibitor可以降低miR-34c的表达,低表达模型构建成功；Vaspin干预低表达模型后我们发现Vaspin的成骨抑制作用减弱；4.低表达miR-34c可以增强Runx2蛋白表达,但Runx2mRNA无明显变化；过表达miR-34c可以抑制(?)Runx2蛋白表达,同样的Runx2mRNA无明显变化；结合前人的研究证实Runx2是miR-34c的靶基因；5. Western blot结果显示Vaspin可以刺激MC3T3-E1细胞内p-Akt表达,在给予Vaspin后5分钟即有p-Akt表达,15分钟表达达到峰值；6. LY294002可以阻断p-Akt表达；LY294002预处理MC3T3-E1后给予Vaspin干预,qRT-PCR结果显示LY294002可以阻断Vaspin对miR-34c表达的促进作用；7.给予LY294002预处理MC3T3-E1,加入Vaspin干预后发现LY294002可以减弱Vaspin的成骨抑制作用；8. MC3T3-E1转染miR-34c inhibitor后给予Vaspin干预,western blot显示p-Akt表达较对照组增加,c-met蛋白表达增加,c-met mRNA无明显变化。结论1. Vaspin可以抑制MC3T3-E1的成骨分化,且该抑制作用具有剂量依赖效应；2. miR-34c表达升高是Vaspin抑制MC3T3-E1成骨分化的可能机制；3. miR-34c与PI3K-Akt信号通路相互作用组成了一个调控环路共同参与了Vaspin对MC3T3-E1成骨分化的调控。第二部分MicroRNA-34c在间充质干细胞自发成骨分化过程中的作用机制研究背景骨髓间充质干细胞(MSC)是一类具有自我更新以及多向分化潜能的原始细胞,是体内成骨细胞的主要来源,它的增殖及成骨分化对于维持成骨细胞的数量具有重要的意义。研究发现随着年龄的增加,骨髓内的MSC数量逐渐减少并伴有细胞状态的老化,同时也有研究发现MSC在老化过程中会发生自发的成骨分化,其具体机制目前尚不明确。MiR-34c是一类在干细胞分化及骨代谢调节中发挥着重要作用的miRNA,所以我们推测miR-34c的表达变化是MSC自发成骨分化的可能机制之一。目的检测在人MSC自发成骨分化过程中miR-34c的表达变化其及启动子区甲基化程度的变化,探索miR-34c在MSC自发成骨分化过程中的作用及调控机制。方法通过多次传代构建老化MSC模型,通过对硝基苯酚法、放免法及western blot检测MSC在自发老化的过程中ALP活性、OC分泌以及Runx2蛋白的表达变化,明确在MSC老化过程中其成骨能力的改变；用qRT-PCR检测miR-34c的表达变化,Lipo2000转染miR-34c mimics/inhibitor构建miR-34c过表达/低表达模型,通过研究自发分化中miR-34c的表达变化以及不同表达状态miR-34c对成骨分化的影响,从而证实miR-34c参与了MSC老化过程中成骨能力变化的调控。通过亚硫酸盐测序(BSP),检测miR-34c启动子区的甲基化程度及qRT-PCR检测DNMTs的表达,研究甲基化在miR-34c表达水平中的调控作用；用5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-dC)分别干预老化的MSC3天及6天,抽提细胞总RNA,用qRT-PCR检测miR-34c, DNMTs mRNA的表达变化证实甲基化是miR-34c表达变化的可能机制之一。结果1.我们成功分离出骨髓间充质干细胞并构建了体外扩增模型；2.经过流式细胞仪及分化诱导后染色,结果证实所分离细胞表达MSC特异性表面分子且具有双向分化潜能；3.随着传代次数的增加,MSC中Runx2蛋白表达上调、ALP活性增加、OC分泌增多,提示MSC在老化过程中会发生自发的成骨分化；4.随着传代次数的增加,miR-34c的表达下降,使用Lipo2000转染miR-34c mimics构建过表达模型,MSC中ALP活性降低、OC分泌减少、Runx2蛋白表达下调,但Runx2mRNA表达无明显变化,结合前人的研究成果我们推测miR-34c通过调控Runx2的变化参与了MSC的自发成骨分化；5.亚硫酸盐测序证实在多次传代过程中miR-34c启动子区甲基化程度上调；6.随着传代次数的增加,DNMT1mRNA表达明显上调,DNMT3A及DNMT3B mRNA表达无明显变化,提示我们DNMT1表达升高是miR-34c启动子区甲基化程度增加的可能机制；7.5-Aza-dC干预老化MSC后DNMT1mRNA表达下调,miR-34c表达上调,证实DNMT1介导的启动子区甲基化是miR-34c在MSC自发成骨分化中表达下降的可能机制。结论miR-34c启动子区甲基化程度增加所致的miR-34c表达下调是骨髓间充质干细胞自发成骨分化的可能机制之一。