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乳腺癌(breast cancer)是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤,位列女性恶性肿瘤首位。其中三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)因其雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及人表皮生长因子受体2(HER2)均呈阴性,临床无有效的靶向治疗方法,其肿瘤异质性高、分化程度低、侵袭、转移能力强,预后较差,成为临床治疗的难题。因此,寻找TNBC新的肿瘤标志物并对其作用机制进行研究将为TNBC的临床治疗新靶点及新治疗方案的选择提供理论依据。淋巴细胞调节蛋白 LNK(lymphocyte adaptor protein,LNK)又称为 SH2B3,是 SH2B家族的成员,在机体生长发育、代谢平衡和免疫调节等诸多方面发挥着重要的调控作用。在造血系统中,LNK通过负向调节JAK2的活性从而抑制其下游多个信号通路,维持造血系统的稳态。课题组首先利用数据库分析了不同受体表达类型乳腺癌临床病例中LNK的表达水平,发现LNK在TNBC中存在高表达的现象。随后,收集人乳腺癌临床样本石蜡切片,在人乳腺癌石蜡组织及人乳腺癌细胞株中检测LNK的表达,继而通过沉默和过表达LNK的方式研究LNK对人乳腺癌发生发展的影响,并对LNK在TNBC中的机制进行初步探讨,为TNBC的治疗提供新的靶点和理论依据。方法:1.收集TNBC及非TNBC患者的肿瘤样本石蜡组织切片,免疫组织化学(IHC)方法分析其LNK的表达水平。2.Western blot和qRT-PCR方法分析人乳腺癌细胞株(TNBC及非TNBC)中LNK的表达。3.将 pLKO-shLnk-puro、pLKO-shLnk-83#、pLKO-shLnk-84#质粒与相应的包装质粒(VS VG、pMDL、pREV)共转染293T细胞,包装产生慢病毒。用该病毒液感染相应的人乳腺癌细胞株:MDA-MB-231(MB-231)(ER-、PR-、HER2-)、Hcc1937(ER-、PR-、HER2-)、MCF-7(ER+、PR-、HER2-),嘌呤霉素筛选,构建相应的LNK敲减稳转细胞株。经western blot、qRT-PCR实验分析各细胞株中LNK的mRNA水平及蛋白水平,验证LNK的敲减效果;平板克隆、CCK-8实验分析敲减LNK对上述人乳腺癌细胞株增殖的影响;流式细胞术分析敲减LNK对MCF-7、MB-231细胞凋亡和周期的影响;Transwell小室侵袭实验分析敲减LNK对MB-231侵袭能力的影响。4.将LNK过表达质粒pOZ-hLNK以及包装质粒pCLAmpho共转染MB-231细胞,构建过表达LNK的稳转细胞株,以pOZ-FH为对照质粒同步包装。根据病毒载体上的筛选标签IL-2R,通过流式细胞术分选IL-2R阳性细胞,共分选2次。Western blot分析LNK过表达情况;平板克隆、CCK-8实验检测过表达LNK对MB-231增殖的影响;Transwell小室侵袭实验检测过表达LNK对MB-231侵袭能力的影响。5.初步探索LNK高表达促TNBC发生发展的机制,通过western blot检测LNK过表达情况下信号分子 JAK2、STAT3、p-STAT3、STAT5,p-STAT5、p38、p-p38、AKT 以及 14-3-3家族的蛋白水平。结果:1.TNBC、非TNBC患者肿瘤样本石蜡组织切片的IHC结果表明,LNK在TNBC样本中呈高表达。2.Western blot及qRT-PCR结果表明,人TNBC细胞株中LNK在mRNA水平及蛋白水平上均呈高表达。3.Western blot、qRT-PCR结果表明,成功构建敲减LNK的稳转细胞系(MCF-7、MB-231、Hcc1937),LNK在mRNA水平及蛋白水平均得到下调。平板克隆、CCK-8增殖实验结果表明,LNK敲减后促进MCF-7细胞的增殖,但显著性地抑制了 TNBC细胞株MB-231、Hcc1937的增殖;细胞周期实验表明MB-231细胞敲减LNK后,其G0/G1期与S期均下降,G2期增高;凋亡实验表明,敲减LNK后,细胞凋亡水平升高;Transwell小室侵袭实验结果表明,敲减LNK后MB-231细胞的侵袭能力急剧下降。以上结果提示,在TNBC细胞株中下调LNK具有抑制肿瘤发展的作用。4.成功构建过表达LNK的MB-231稳转细胞株。平板克隆、CCK-8实验都证实LNK过表达后TNBC细胞株MB-231的增殖显著;Transwell小室侵袭实验结果表明,过表达LNK后,MB-231的侵袭能力显著性增强。提示,在TNBC细胞株中,LNK上调具有促进TNBC进展的作用,可能是作为肿瘤增强子存在。5.Western blot结果表明,在MB-231中过表达LNK,上调了细胞中STAT3、p-STAT3的蛋白表达水平,P-STAT5、AKT以及14-3-3的蛋白水平没有显著性变化,提示LNK过表达促癌作用可能主要通过JAK2-STAT3通路进行。结论:LNK高表达促进TNBC的发生发展,其可能通过上调JAK2-STAT3信号通路起到肿瘤增强子的作用。