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目的B细胞淋巴瘤是一种发生于淋巴结及其它淋巴组织的肿瘤,它分为两类,即霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。本文的主要研究对象为非霍奇金淋巴瘤。c-Myc基因是一种原癌基因,能够促进DNA的修复以及调节细胞周期,从而影响细胞的增殖、分化和凋亡。近年来,越来越多的研究表明,c-Myc基因在非霍奇金淋巴瘤的发生、发展以及治疗中发挥着重要的作用。课题组前期构建了 c-Myc诱导表达的B细胞淋巴瘤模型,并通过芯片技术检测超保守区域转录本(Transcribed ultraconserved regions,T-UCRs)在c-Myc激活和失活状态下的差异表达,发现其中有几种T-UCRs表达量有明显差异,其中一个就是uc.12+A。本课题旨在通过研究uc.12+A对B细胞淋巴瘤生长的影响,并进一步探讨其机制与作用。方法1.首先,构建Myc-on和Myc-off的小鼠B细胞淋巴瘤模型,运用芯片检测表达水平发生显著变化的T-UCRs,确定研究对象为uc.12+A。利用普通RT-PCR与链特异性RT-PCR检测uc.12+A在B淋巴瘤细胞系中的表达水平,观察其结果是否与芯片检测结果一致。2.uc.12+A过表达逆转录病毒质粒的构建:根据UCbase数据库获取uc.12+A的基因序列,PCR扩增该基因序列,并选择逆转录病毒pMSCV-PIG载体,将目的基因通过双酶切构建到载体中,获得含有目的基因的重组质粒,对于测序正确的重组质粒,提取和纯化高质量的重组质粒。3.细胞转染与感染:将构建好的质粒uc.12+A-pMSCV-PIG通过PEI转染法转染到293T细胞中,收集36 h、48 h、60 h、72 h的含病毒的上清液,细胞感染备用。用含病毒的上清液分别感染38B9细胞和Romas细胞,并用polybrene增强感染率,48h后取适量细胞,运用流式细胞术测感染率,随后用puromycin进行筛选,直到感染率达到80%以上。4.体外和体内实验:将感染后细胞分为两个组,MSCV对照组及过表达uc.12+A组。运用细胞计数法检测过表达uc.12+A对B淋巴瘤细胞增殖的影响,共计数四天,并作折线分析;运用流式细胞技术检测过表达uc.12+A对B细胞淋巴瘤的细胞周期和凋亡的影响;将过表达uc.12+A和MSCV对照组的细胞分别注入小鼠皮下,12天后取肿瘤组织并比较其大小和重量,以观察过表达uc.12+A对B细胞淋巴瘤生长的影响。5.通过生物学网站查找uc.12+A的宿主基因,确定其宿主基因为SFPQ(脯氨酸谷氨酰胺富含性剪切因子),通过RT-PCR检测SFPQ在过表达uc.12+A的38B9及Romas细胞中的mRNA表达水平,并与MSCV对照组对比;运用Western-blot检测SFPQ在过表达uc.12+A的38B9及Romas细胞中的蛋白表达水平,同样与MSCV对照组进行对比。结果1.RT-PCR结果显示,在38B9和myc3细胞中,uc.12+A的表达明显高于在小鼠骨髓B细胞中的表达,与芯片检测结果一致。运用普通PCR及链特异性PCR检测uc.12+A的表达情况,对比发现,两组总体趋势一致,即uc.12+A的表达在淋巴瘤细胞中都呈增高趋势,但链特异性PCR组的表达明显低于普通RT-PCR检测组,说明链特异性PCR检测uc.12+A的表达水平结果更准确,能排除顺义链对检测结果的干扰。2.细胞体外计数结果显示,过表达uc.12+A的细胞增殖速度高于MSCV对照组,说明过表达uc.12+A后,B细胞淋巴瘤增殖速度加快;细胞周期实验表明,过表达uc.12+A后,S期细胞比例增高,提示细胞增殖分裂旺盛;细胞凋亡实验显示,过表达uc.12+A后,细胞凋亡率下降;小鼠体内荷瘤实验显示,过表达uc.12+A的细胞在小鼠体内生长速度加快。以上实验均说明过表达uc.12+A能促进B细胞淋巴瘤的生长。3.RT-PCR结果显示,在过表达uc.12+A的情况下,SFPQ的表达水平同样升高,两者呈正相关趋势;Western-blot检测过表达uc.12+A组与MSCV对照组的SFPQ蛋白表达水平显示,过表达uc.12+A时,SFPQ的蛋白表达水平也相应增高,趋势与RT-PCR检测结果一致。结论1.uc.12+A在B细胞淋巴瘤中表达增高,在体内和体外,它都能起到促进B淋巴瘤细胞生长的作用。2.SFPQ作为uc.12+A的宿主基因,其表达水平的变化与uc.12+A的表达呈正相关趋势。