【摘 要】
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研究目的:本课题通过细胞分子生物学和体内动物实验,进行探索与验证缝隙连接蛋白α1（GJA1）如何介导下游靶点RALA,激活Hippo抑癌通路的内部信号传导,最终影响肝细胞癌（HCC）的进展。我们希望通过实验研究进一步阐明GJA1对HCC的生物学作用及HCC潜在的发展机制。研究方法:在本课题前期的研究中,我们已经证实GJA1在HCC组织中的表达具有显著差异,以及GJA1和HCC患者生存预后之间的关系
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研究目的:本课题通过细胞分子生物学和体内动物实验,进行探索与验证缝隙连接蛋白α1（GJA1）如何介导下游靶点RALA,激活Hippo抑癌通路的内部信号传导,最终影响肝细胞癌（HCC）的进展。我们希望通过实验研究进一步阐明GJA1对HCC的生物学作用及HCC潜在的发展机制。研究方法:在本课题前期的研究中,我们已经证实GJA1在HCC组织中的表达具有显著差异,以及GJA1和HCC患者生存预后之间的关系。我们还利用生物信息学方法鉴定了差异表达基因（DEGs）,并对其功能和途径富集进行了分析,推测RALA是GJA1的下游靶点。本次课题研究中,我们再次证实GJA1在HCC患者标本组织中的表达水平具有差异。在体外的细胞实验中,通过对Hep3B细胞转染质粒过表达GJA1,对PLC/PRF/5细胞进行转染si RNA沉默GJA1的表达。通过CCK8实验,探究GJA1对Hep3B和PLC/PRF/5细胞增殖活性的影响;Hep3B和PLC/PRF/5细胞的迁移能力检测主要采用细胞划痕实验和Transwell实验;细胞的侵袭活性的测定主要采用Invasion实验进行分析。为进一步探索和验证GJA1是否通过调控RALA影响HCC的分子机制,我们使用Western Blot探究GJA1、RALA和Hippo信号通路三者的调控关系,通过体外细胞生物学实验进一步探索GJA1如何介导RALA激活Hippo抑癌通路的信号传导,从而影响HCC细胞的进展。此外,由慢病毒构建稳定表达GJA1的Hep3B细胞株,分别通过皮下注射,建立3组裸鼠模型,包括稳定表达GJA1组（Lv-GJA1组）、阴性对照组（Lv-con组）及共转染组Lv-（GJA1+RALA）。饲养小鼠期间定期记录其生长情况,至30天后取出肿瘤进行后续实验,进一步论证GJA1如何介导RALA激活Hippo抑癌通路的信号传导,从而影响HCC的进展。实验结果:（1）GJA1在HCC组织中的表达量情况为:癌组织低于癌旁组织;在HCC细胞株中的表达量情况为:其他肝癌细胞低于正常肝脏细胞。（2）Hep3B细胞中GJA1过表达（pc DNA-GJA1）组的细胞增殖、迁移和侵袭活性相较于对照组减弱,PLC/PRF/5细胞中的GJA1沉默（si-GJA1）组的细胞增殖、迁移和侵袭活性相较于对照组增强。（3）在Hep3B细胞中GJA1的过表达下调了RALA的蛋白表达水平,而在GJA1被敲低的PLC/PRF/5细胞中却表现为RALA的蛋白表达水平上调,由此看来,二者的表达呈负相关关系。此外,TCGA数据库检索后发现RALA在HCC组织中的表达情况为:癌组织高于癌旁组织,并且RALA高表达组的HCC患者预后更差。（4）通过体外细胞生物学实验发现,RALA具有可以逆转GJA1对HCC细胞增殖、迁移和侵袭的作用。（5）在Hep3B细胞中过表达GJA1后,RALA蛋白表达水平下降,Hippo信号通路中LATS1和YAP的磷酸化水平增加;在PLC/PRF/5细胞中沉默GJA1后,RALA蛋白表达水平增加,LATS1和YAP的磷酸化修饰水平降低。（6）体内实验结果显示GJA1的高表达可以抑制裸鼠体内肿瘤的生长,并且其效应可以被RALA所逆转。结论:GJA1的表达上调通过调控下游蛋白RALA的表达,激活Hippo抑癌信号路的内部信号传导,促进LATS1和YAP的磷酸化水平升高,最终阻止YAP入细胞核转录翻译,从而抑制HCC细胞的进展,如增殖活性、迁移和侵袭的能力。
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