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抗菌肽(Antimicrobiall peptides;AMPs)是生物体内免疫系统产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子多肽;广泛存在于自然界生物体中。抗菌肽的来源非常广泛;大体分为天然抗菌肽和人工抗菌肽。天然抗菌肽提取于自然界中的各种动物体和植物体;从中分离出各种具有抗菌活性的内源性肽;即为抗菌肽。人工抗菌肽来源主要有两种途径;分别为基因工程法制备抗菌肽和化学合成法制备抗菌肽。由于从自然界中提取天然抗菌肽的资源有限;用传统方法制备的抗菌肽产量极低;步骤繁琐耗时长;无法实现大规模制备抗菌肽来满足人类的需求。用化学合成的方法制备抗菌肽;虽然方便快捷;但是存在成本高昂;容易造成环境污染等缺点;致使目前用于规模化生产的产品较少。而利用基因工程技术来制备抗菌肽具有成本低廉、操作简便;易于规模化生产等优点;具有广阔的应用前景。所以利用基因工程技术来制备抗菌肽是目前最有效的途径。部分抗菌肽存在抗菌活性低及对真核生物有溶血作用的缺点。因此;通过对抗菌肽进行分子改造来提高其活性和降低其毒性成为人工抗菌肽研究的重中之重。而抗菌肽的分子改造也是抗菌肽药物开发的热点与难点。 本试验以实验室已有的家蝇抗菌肽为母肽;再选取抗菌活性强的几株抗菌肽为母肽;分别截取各自的活性中心进行杂合;筛选出抗菌活性较强的抗菌肽;再用基因工程的方法对杂合肽进行大量制备。以实验室已有的家蝇抗菌肽MDAP-2、蛙胃粘膜抗菌肽 BuforinⅡ、BuforinⅡ的衍生肽 BuforinⅢc、天蚕素Cecropin A、Apidaecin IA为母体肽;分别对其氨基酸序列进行生物信息学分析设计;选取活性中心;进行不同片段间的杂合;形成杂合肽;将杂合肽送至生物公司进行化学合成;对化学合成的杂合肽进行体外抑菌活性的测定;筛选出抗菌活性与母体肽相当;且存在较低溶血活性的杂合肽BM16。进一步对杂合肽BM16进行结构改造;以提高其抗菌活性;降低其溶血活性。在获得了抗菌活性强;溶血活性低的杂合肽BM16-R的基础上;运用PCR方法扩增得到BM16-R全长基因;将杂合肽基因与 pET-28a(+)-Ub 表达载体相连接;构建重组表达质粒pET-28a(+)-Ub-BM16-R;将其转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达;经SDS-PAGE电泳和Western-blot检测目的蛋白的表达;采用Ni2+亲和层析柱纯化获得具有活性的融合蛋白;并用 SUMO 蛋白酶酶切;获得高纯度抗菌蛋白;并用改良的二倍稀释法对其抑菌活性进行检测;结果杂合抗菌肽BM16-R的抗菌活性强于母体肽;且溶血活性低;为开发新型抗菌肽提供思路。主要实验结果如下: 1.利用生物信息学分析软件设计并合成5个杂合抗菌肽;进行体外抑菌活性测定; 筛选出活性较好的杂合肽BM16。 2.对BM16氨基酸的进一步改造;用精氨酸(R)分别取代BM16中的11位苯丙氨酸(F)和14位亮氨酸(L);进行体外抑菌和溶血活性测定;成功获得抗菌活性强且溶血活性低的杂合肽BM16-R。 3.通过 PCR 扩增方法扩增得到 BM16-R 全长基因;并成功构建了pET-28a(+)-Ub-BM16-R原核重组表达质粒;并成功转化至大肠杆菌(E.coli)BL21 (DE3)中融合诱导表达;SDS-PAGE电泳显示;获得13kDa的目的蛋白。 4.通过Ni2+亲和层析纯化获得融合抗菌蛋白Ub-BM16-R;经过SUMO酶酶切和分子筛过滤层析;获得抗菌蛋白BM16-R;经过体外抑菌活性分析显示;其对革兰氏阴性菌有较强的抑菌活性;如对大肠杆菌的MIC值为2μg·mL-1;对沙门氏菌的MIC值为4μg·mL-1。对革兰氏阳性菌的抗菌活性较低;如对金黄色葡萄球菌的MIC值为16μg·mL-1。