线形动物门(Nematomorpha)是自然界中分布最广、数量最多的一大类无脊椎动物,其生境多样,大部分行自由生活栖息于土壤、淡水和海水中,少部分种类行寄生生活,寄生于包括人体在内的多种动植物寄主体内。根结线虫、松材线虫、大豆包囊线虫以及茎线虫是主要的植物寄生线虫,严重危害农业和林业经济的发展。由于植物寄生线虫分布在土壤、植物根部等隐蔽地方,物理防治方法很难根除病害。因此,生物防治成为目前防治植物寄生线虫的重要一环,特别是食线虫微生物资源的开发和利用,已经成为研究热点。本实验室前期实验已经证明一株丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)MB03活菌体、发酵上清液及细胞破碎液都能够有效杀死秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和南方根结线虫(Meloidogyneincongnita),本研究通过表达该菌株潜在的杀线虫蛋白和多重生物测定分析,对相关蛋白的杀线虫活性以及对线虫生长、繁殖和定殖等方面的影响进行了研究。通过将丁香假单胞菌MB03全基因组序列与Virlent Pred毒性蛋白数据库中序列比对筛选、以及与已报道的杀线虫蛋白序列综合比对分析,从中筛选出120个可能表达杀线虫毒性蛋白的基因。筛选结果表明,可能的杀线虫毒性蛋白主要有蛋白酶类、粘附素、Rhs家族蛋白、菌毛相关蛋白等。本研究利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达纯化系统,构建了 3个表达不同潜在杀线虫基因的大肠杆菌受体菌,并利用秀丽隐杆线虫作为生测虫体,对9株重组大肠杆菌的杀虫活性进行了生物测定,进行杀线虫蛋白初筛。在此基础上,对其中3个潜在杀线虫基因进行原核表达纯化,分别是重组菌MB3672、MB4948和MB2407,得到3个潜在的杀线虫毒性蛋白的纯化蛋白,即2-甲基乌头酸异构酶(2-methyl-aconitate isomerase)、中性锌金属蛋白酶(Neutral zinc metalloprotease)和一个 Rhs 家族蛋白。重组菌菌体的秀丽隐杆线虫生测实验结果表明,重组菌MB3672对线虫的致死率最大为65.3%,其纯化蛋白的秀丽隐杆线虫生测实验结果表明,2-甲基乌头酸异构酶在液体杀虫中有明显杀虫作用,其LC5o是155.3(123.4～176.6)μg/mL,线性回归方程(线性相关系数)Y =-35.55 + 16.27x(0.942),LT50 是 3.72(1.64～4.85)d。该蛋白浓度为450 μg/mL时,L1期生长抑制实验中实验组线虫面积占对照组线虫的72%,减小了 28%,可知该蛋白对L1期线虫生长率有抑制作用。线虫产卵率影响实验结果表明,蛋白浓度为180 μg/mL时,实验组线虫的产卵率为对照组线虫的68%,该蛋白对线虫产卵率有32%的抑制作用。当蛋白浓度450 μg/mL时,处理后的实验组线虫的运动轨迹波长与对照组线虫运动轨迹的波长相比减小了 1.05倍,振幅减小了 1.52倍,说明该蛋白对线虫运动有影响。FITC荧光观察及病理观察表明,该蛋白作用于线虫的肠道部位。另外,中性锌金属蛋白酶和Rhs家族蛋白在PG固体平板上与线虫作用14天后有明显的杀虫效果,致死率分别是56.71%和66.25%。纯化蛋白对秀丽隐杆线虫生测实验结果表明,中性锌金属蛋白酶浓度是67 μg/mL时,致死率最高为29.22%,Rhs蛋白浓度为83 μg/mL时,致死率最高为30.01%。中性锌金属蛋白浓度是94.8μg/mL,Rhs家族蛋白浓度为198.5μg/mL时,与L1期线虫作用72 h后对线虫生长抑制率分别是19%和11%。当蛋白浓度为180 μg/mL时,中性锌金属蛋白酶对线虫产卵率抑制了 22%,Rhs家族蛋白对线虫产卵率抑制了 25%,中性锌金属蛋白酶对线虫运动影响较大,实验组线虫运动波长较对照组线虫减小1.12倍,振幅减小3.04倍,Rhs家族蛋白作用的实验组线虫运动波长较对照组增加1.01倍,振幅减小1.27倍。纯蛋白对南方根结线虫生测实验结果表明,中性锌金属蛋白酶浓度为80 μg/mL时,对根结线虫的致死率达到80%,毒性最大。Rhs家族蛋白浓度是200 μg/mL时,致死率为38.94%,2-甲基乌头酸异构酶浓度为250 μg/mL时,致死率为34.90%。