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刺激隐核虫病是由刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans）感染鱼体刺激粘液大量产生,导致鱼窒息或继发细菌感染而死的寄生虫病,给我国海水硬骨鱼养殖产业造成了巨大的经济损失,迫切需要从分子水平探讨该虫发育和感染的机理,利用现代基因工程技术,寻找安全有效的防治方法。肌动蛋白（Actin）细胞骨架参与细胞分裂、运动、生长、形状维持等;肌动蛋白解聚因子ADF通过切断肌动蛋白丝（F-Actin）从而结合到肌动蛋白单体（G-actin）上,加速细胞内肌动蛋白的转换率,在肌动蛋白细胞骨架的动态变化中发挥重要作用;组装抑制蛋白（Profilin）是重要的肌动蛋白结合蛋白,在一定程度上Profilin延缓了肌动蛋白（Actin）的聚合,使其更有序的进行聚合或延缓作用,且某些物种的profilin可作为佐剂增强免疫反应。有研究表明细胞骨架在寄生虫入侵宿主过程以及不同发育期的转换过程中扮演着重要的角色,在细胞定向运动中发挥着关键的作用。为了今后探讨刺激隐核虫细胞骨架相关蛋白在入侵宿主和不同发育期的转换过程中的作用,本研究从已构建的刺激隐核虫滋养体c DNA文库中筛选出了肌动蛋白基因（CiActin）进行原核重组表达,并制备了抗血清,分析了该基因在刺激隐核虫生活史各期的表达情况;构建了刺激隐核虫肌动蛋白的真核表达载体pcDNA/CiActin,检测了其在鱼细胞中的表达情况;初步评估了CiActin及其调节分子CiProfilin的核酸疫苗及CiADF1的重组亚单位疫苗用于免疫预防的价值。具体的实验结果如下:刺激隐核虫肌动蛋白基因（CiActin）的表达和特征分析:CiActin（Gen Bank ID:JN399999）开放阅读框为1131 bp,其理论分子量为42 k Da。将其用于编码谷氨酰胺的非通用密码子TAA和TAG改成该氨基酸的通用密码子CAA和CAG后进行全序列合成,扩增后插入到载体上形成重组质粒p GEX-4T-1/CiActin,将该质粒转化入大肠杆菌DH5α菌株中,经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷在37℃诱导表达融合重组蛋白（rCiActin）。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示:以包涵体形式存在的rCiActin分子量是68.0 k Da,与理论值相符。用rCiActin免疫无特定病原体的小鼠,制备抗rCiActin鼠血清。用该血清做免疫印迹试验,结果显示在刺激隐核虫各发育阶段的虫体中内源CiActin均有表达,其分子量与理论值一致。此外,间接免疫荧光抗体试验结果显示内源CiActin多聚集分布在细胞质膜周围,且在幼虫体胞口处更富集。刺激隐核虫肌动蛋白基因在鱼细胞中的表达:构建了真核表达载体pcDNA/CiActin;将本研究室用于刺激隐核虫人工传代保种的褐菖鲉的鳍条组织用胰蛋白酶处理后原代培养,成功地分离和传代培养了类似上皮细胞与成纤维细胞的两个细胞系,大部分细胞的染色体计数为48,显示它们具有与褐菖鮋体细胞相同的染色体数48,目前均已传代至44代左右,生长状态良好。用pcDNA/CiActin转染这些鱼细胞,间接免疫荧光抗体试验检测结果显示刺激隐核虫的CiActin基因能在该鱼细胞中表达。刺激隐核虫肌动蛋白及其相关分子应用价值评估:CiProfilin、CiActin及CiProfilin-CiActin的真核表达质粒pcDNA/CiProfilin、pcDNA/CiActin及pcDNA/CiProfilin-CiActin对大黄鱼的免疫效果,结果显示:这些DNA的注射对大黄鱼抵抗亚致死剂量刺激隐核虫感染的免疫保护率分别为49%、52%、28%,而作为对照的空载体pcDNA的为9%。说明pcDNA/CiActin,pcDNA/CiProfilin及pcDNA/CiProfilin-CiActin的免疫对大黄鱼均起到了一定的保护作用。在前期研究中克隆了刺激隐核虫的肌动蛋白解聚因子基因CiADF1,本实验用它的重组蛋白rCiADF1免疫大黄鱼,发现它对大黄鱼遭受刺激隐核虫幼虫攻毒的免疫保护率为59%。免疫与未免疫的各组大黄鱼的肝、脾和肾中免疫相关基因的表达情况:pcDNA/CiProfilin免疫组和pcDNA/CiProfilin-CiActin免疫组的大黄鱼肝脏和脾脏中IL-1β表达上调明显,pcDNA/CiActin免疫组的大黄鱼肝脏中MHCII和IRF7表达略有上调;rCiADF1免疫组的大黄鱼肝和脾中IL-1β表达上调明显。说明刺激隐核虫肌动蛋白细胞骨架相关蛋白rCiADF1和CiActin、CiProfilin基因均能引起大黄鱼免疫相关基因的表达。综上所述,本研究对刺激隐核虫的肌动蛋白进行了特征分析,制备了抗血清,为后续肌动蛋白细胞骨架的研究打下了基础;通过建立鱼的细胞系,转染pcDNA/CiActin,表明刺激隐核虫基因能够在鱼细胞中表达;肌动蛋白细胞骨架相关蛋白或基因免疫大黄鱼的实验结果显示:重组蛋白rCiADF1和CiActin、CiProfilin基因均能够影响大黄鱼免疫相关基因的表达,对大黄鱼具有一定的免疫保护作用,为刺激隐核虫感染的免疫预防策略的制定提供了参考。