大黄鱼（Larimichthys crocea）是我国四大海产品之一,在渔业经济中占据重要地位。近年来,随着养殖业的不断发展,渔业养殖密度增加,使刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans）的传播更容易,导致“海水白点病”频繁大规模爆发,对大黄鱼的养殖造成非常大的经济损失,尚无较安全有效的防治方法。以往的研究显示刺激隐核虫能够诱发宿主产生保护性免疫反应。因此基因工程疫苗,特别是DNA疫苗和亚单位疫苗在刺激隐核虫防治方面是否存在较好的发展前景引起了我们的注意。寄生原虫的表面抗原被认为是主要的免疫显性抗原,参与寄生虫与宿主之间的相互作用,可能是免疫预防的主要靶点之一。因此本实验初步评估了刺激隐核虫表面抗原（Genbank:JF812643.1）的一个截短的片段（Ci SA32.6t）的重组蛋白及其重组真核表达质粒对大黄鱼抵抗亚致死剂量的刺激隐核虫幼虫攻毒的免疫保护效果。具体实验结果如下:构建了大黄鱼免疫球蛋白Ig M的原核表达系统:为便于检测大黄鱼免疫前后的抗体水平消长情况,本实验从数据库NCBI中获得大黄鱼免疫球蛋白Ig M完整m RNA序列（Gen Bank:FJ589726.1）,并构建了大黄鱼免疫球蛋白Ig M的重链恒定区部分片段（Lc Ig Ht）的原核表达系统。用其表达的重组蛋白r Lc Ig Ht免疫小鼠,制备了抗血清。Western blotting分析显示r Lc Ig Ht具有良好的免疫原性和反应性,r Lc Ig Ht免疫鼠血清能够特异性识别大黄鱼血清中的天然Ig M蛋白。同时,天然大黄鱼血清Ig M免疫鼠后获得的抗血清也能识别该重组蛋白r Lc Ig Ht。用r Lc Ig Ht免疫鼠血清的抗体滴度最高达到了102400,为刺激隐核虫感染的免疫诊断,以及免疫效果的评价等奠定了基础。刺激隐核虫表面抗原Ci SA32.6t的重组表达:本实验利用p ET28a为载体构建了表面抗原Ci SA32.6t的原核表达系统。Ci SA32.6t由852个碱基组成,编码283个氨基酸,分子量理论值为29.9 k Da。重组蛋白r Ci SA32.6t带六个组氨酸标签,标签大小约6 k Da,与本实验室前期表达的的与谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合的重组蛋白比较,可能受标签蛋白的影响较小,能暴露更多的抗原表位。经Western Blotting分析显示,鼠抗刺激隐核虫滋养体血清能够与该重组蛋白结合;此外,本实验还构建了真核表达的重组质粒pc DNA/Ci SA32.6t。间接免疫荧光抗体试验的结果表明,该质粒可在大黄鱼鳃和脑细胞中成功表达,为下一步的大黄鱼免疫实验提供材料。以重组蛋白r Ci SA32.6t和质粒pc DNA/Ci SA32.6t作为候选疫苗免疫大黄鱼,与阴性对照组相比,它们对大黄鱼抵抗亚致死剂量的刺激隐核虫感染的相对保护率分别是50.10%和36.26%,初步证明此两种抗原对大黄鱼的刺激隐核虫感染有一定的免疫保护作用,经Real Time-PCR检测后发现注射两种抗原后鱼体的免疫相关因子IL-1β和Ig M的表达出现不同程度的上调,而MHC II则免疫前后的表达变化不明显。综上所述,本实验为大黄鱼刺激隐核虫感染的血清学诊断以及后继免疫防治方法的进一步开发提供了基础资料。