牦牛血IgG分离纯化工艺及其稳定性研究

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牦牛是一种在低污染生态环境下生存的珍稀物种,其血液中的IgG含量是普通肉牛血液中含量的3倍,该论文研究以新鲜的牦牛血经过去除凝血酶,冷冻离心分离的血清为原料,分别研究了FeCl3盐析法和多聚磷酸盐沉淀法提取牦牛血中IgG的最优工艺参数,离子交换层析、凝胶过滤层析和SDS-PAGE对IgG的纯化条件,研究不同条件下IgG的稳定性,主要研究结果如下:(1) FeCl3盐析法提取牦牛血中的IgG的最优工艺参数:反应温度为34℃、氯化铁浓度为2.7mmol/L、 pH值为4.4、反应时间为1.8h,在此条件下IgG的提取量为8.28mg/mL。(2)多聚磷酸盐沉淀法提取牦牛血中的IgG的最优工艺参数:反应温度为32℃、多聚磷酸盐浓度为0.1%、pH值为3.7、反应时间为1.7h,该工艺条件下牦牛血IgG提取量为6.48mg/mL。(3)对粗提的IgG进行纯化,得到一个洗脱峰,分布在12~27管之间,IgG由淡黄色的液体转变为白色的液体,说明其他杂蛋白已被过滤,继续洗脱,未发现其他组分。对纯化的IgG进行纯度鉴定,表明与纯度为≥95%IgG标准品的条带无异且无出现其他蛋白。(4)在不同反映环境下,IgG的稳定性发生变化,在中性环境下和65℃以上,IgG损失速度较快,并在75℃加热1h时,IgG完全失活。在pH值为2.0时,IgG的保留率为40%,在pH值为4.5条件下,在65℃和75℃分别加热2h和1h后,IgG完全失活,在pH值为4.0条件下,在65℃和75℃分别加热2h和1h后,IgG完全失活。(5)在温和的反应条件下加入胃蛋白酶和胰蛋白酶,IgG的保留率受到损失,在胃蛋白酶(2000U/mg)添加量为5.0mg/mL反应3h后,IgG的保留率为85.21%,在温和反应条件下,IgG的变性是由胃蛋白酶引起;在胰蛋白酶(200U/mg)添加量为5.0mg/mL反应3h后,IgG的保留率为82.54%,在温和条件下,IgG的变性是由胰蛋白酶引起。(6)在模拟人工消化液中,IgG的稳定性发生变化, IgG在模拟胃液中消化6h后,残存率为1.51%,IgG已经被消化完。IgG在模拟肠液中消化6h后,残存率达50.23%,说明肠道环境对IgG的作用相对比较缓慢。综上所述,FeCl3盐析法和多聚磷酸盐沉淀法能很好的提取牦牛血中的IgG,并且使用离子交换层析和凝胶过滤层析对粗提液的纯化的IgG的纯度较高,牦牛血IgG在酸性和过高温度下容易失活,酶液和人工消化液同样能影响IgG的稳定性。牦牛血液有潜力做为IgG提取的重要来源。
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