【摘 要】
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细菌脂蛋白（bacterial lipoprotein,BLP）,存在于革兰氏阳性细菌细胞壁,是TLR2的激动剂。BLP耐受是指动物或体外培养的巨噬细胞在给予小剂量的BLP预处理后,对BLP再次刺激无反应或反应性明显降低的现象。研究发现BLP耐受不仅可以使再次注射致死剂量BLP的小鼠免于死亡,而且还可以提高无论金黄色葡萄球菌（S.aureus）或者鼠伤寒沙门氏菌（S.typhi）甚至是盲肠穿孔模型
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（No.81072425）； 国家自然科学基金项目（No.81471909）； 广东自然科学基金重点项目（2015A030311031）；
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细菌脂蛋白（bacterial lipoprotein,BLP）,存在于革兰氏阳性细菌细胞壁,是TLR2的激动剂。BLP耐受是指动物或体外培养的巨噬细胞在给予小剂量的BLP预处理后,对BLP再次刺激无反应或反应性明显降低的现象。研究发现BLP耐受不仅可以使再次注射致死剂量BLP的小鼠免于死亡,而且还可以提高无论金黄色葡萄球菌（S.aureus）或者鼠伤寒沙门氏菌（S.typhi）甚至是盲肠穿孔模型导致的脓毒症小鼠的存活率。BLP耐受的内源性保护作用主要体现在天然免疫细胞炎性信号通路的再程序化以及巨噬细胞杀菌能力增强,但是目前对BLP耐受的巨噬细胞杀菌能力增强的机制尚不完全清楚。最近,研究发现自噬可能参与了机体防御病原体感染的过程。自噬广泛存在于真核细胞中,是生物体在其发育、老化过程中清除自身多余或受损细胞器的一种生命现象。目前发现几十种自噬相关蛋白（autophagy associated protein,Atg）参与自噬起始、自噬体的形成、自噬体的成熟等过程,其中Atg5-Atg12-Atg16L1和Atg8（LC3）在自噬体的形成过程中发挥了重要作用。本研究通过以下三个部分的研究探讨了 BLP耐受是否通过增强自噬提高巨噬细胞杀灭细菌的能力及其可能的机制:1.BLP耐受对细菌感染时骨髓来源的巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages,BMDMs）自噬的影响;2.BLP 耐受通过增强自噬提高BMDMs对细菌的杀灭能力;3.BLP耐受激活自噬的分子机制。通过上述研究获得以下结果:第一部分:1.与 Naive BMDMs 相比,S.typhi和S.aureus 感染 BLP 耐受 BMDMs 时 LC3-Ⅱ随着感染时间的延长而增加,同时自噬流加快;2.当给予不同比例的细菌刺激细胞时,无论是Na?ve还是BLP耐受BMDMs 1 h时自噬随着细菌比例数的增加而增强,3 h则趋于一致,但是BLP耐受BMDMs的自噬形成较Na?ve更强;用热灭活的方法减弱细菌毒力后刺激BLP耐受BMDMs,自噬激活较活菌明显减弱。第二部分:1.用自噬的抑制剂3-MA抑制自噬后BLP耐受BMDMs对细菌的杀灭明显减少;2.与 Na?ve pMφ（peritoneal macrophage,pMφ）相比,BLP 耐受 pMφ形成更多自噬体包裹细菌,并且自噬体与溶酶体的融合增加;3.BLP耐受促进囊泡转运蛋白Rab20的表达,并且Rab20能够促进包裹S.aureus的自噬体与溶酶体的融合;用siRNA的方法下调Rab20后,影响溶酶体的酸化以及细菌向溶酶体的运输。第三部分:1.用BLP刺激BMDMs时,自噬以及自噬相关蛋白Atg3和Atg7在1h开始增加,24 h回到基础水平;用氯喹抑制自噬与溶酶体融合后,发现BLP刺激BMDMs 6、12 h自噬流加快;2.自噬相关蛋白Atg5、Atg12、Atg16L1在细菌感染的BLP耐受BMDMs中mRNA和蛋白表达水平明显强于Na?ve BMDMs;3.S.aureus感染时,BLP耐受巨噬细胞Nod2与Atg16L1的相互作用增加;用siRNA的方法下调Atg16L1的表达后,自噬体的形成明显减少,并且BLP耐受BMDMs杀灭S.aureus的能力明显减弱;4.S.typhi不能增加BLP耐受pMφ Nod2-Atg16L1的相互作用,但是增加Atg5在吞噬了S.typhi的囊泡上的募集。综上所述,本研究得出以下结论:1.BLP耐受能增强自噬从而提高巨噬细胞杀菌,并且自噬的激活与细菌的毒力相关;2.BLP耐受巨噬细胞增加细菌感染后自噬的形成可能与上调Atg5、Atg12、Atg16L1的表达有关;3.BLP耐受巨噬细胞通过增加Nod2与Atg16L1的相互作用促进自噬的激活,提高对S.aureus的清除。4.BLP耐受pMφ不能通过Nod2-Atg16L1或p62途径清除S.typhi,可能通过增加Atg5在吞噬了S.typhi的囊泡上的募集从而促进自噬体形成。本研究从自噬角度研究了 BLP耐受巨噬细胞杀菌能力增强的机制,为探索新的防治脓毒症的策略奠定了基础。
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