芽孢是产芽孢细菌在应对不良环境时产生的一种椭圆形,含水量低,耐热性强的休眠结构。产生芽孢细菌在自然界有氧和厌氧环境广泛分布,对于自然条件下的物质循环和能量流动发挥重要作用。有关芽孢的结构,发育过程以及调控机制,在模式细菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中已经得到深入研究。在另一种自然界中广泛分布的蜡样芽孢杆菌（B.cereus）中,有关芽孢的形成过程和调控机制,尚缺乏系统的研究。B.cereus 0-9是从健康小麦根部分离筛选出来的一种生防菌,对于小麦纹枯病等土壤传播植物病害具有较好的防治效果。鉴于芽孢形成是一个不可逆的发育过程且成熟芽孢具有高度的抗逆性,因此研究芽孢的形成机制,对于理解特定条件下产芽孢细菌的分化和适应机制具有重要意义。本研究利用生物信息学分析B.cereus 0-9的基因组序列,选取在B.subtilis中参与芽孢形成的8个同源基因,分别是gdpP,citZ,rny,kinA,kinB,spo0J,mecA,clpC。通过同源重组方法分别敲除基因,获得8个基因缺失突变体,测定突变体的芽孢形成能力,发现gdpP,citZ,rny,kinA,kinB,spo0J,mecA这7个基因敲除后,突变菌株的芽孢形成能力与野生型菌株0-9没有明显差别,表明B.cereus芽孢形成的调控机制与B.subtilis存在明显的差别。然而clpC基因缺失后,突变体ΔclpC的表型与野生型0-9相比明显不同,发现ΔclpC在LBGM固体培养基上菌落褶皱明显增多,运动能力下降,产胞外蛋白酶能力下降,并且clpC基因还参与盐胁迫和高温胁迫的调节,缺失突变ΔclpC在高温,高盐条件下生长能力比野生型菌株0-9差,最重要的是clpC基因缺失后,野生型0-9菌株完全不产生芽孢。上述结果说明clpC基因在菌落形态方面,运动,生长,芽孢形成等方面均参与调节。为了分析clpC在B.cereus 0-9芽孢形成过程中的作用,通过对ΔclpC菌株芽孢形成过程进行染色观察和研究,发现clpC影响芽孢形成的后期阶段。exsB是芽孢形成后期特异表达的基因,参与调控芽孢形成后期胞外壁组分的形成。利用芽孢形成后期特异表达的exsB基因启动子构建转录融合菌株0-9(PexsB-gfp)和ΔclpC(PexsB-gfp),测定该启动子在野生型菌株0-9和缺失突变菌株ΔclpC中的表达动态,结果表明exsB在ΔclpC中不表达,进一步证明clpC基因缺失导致芽孢形成后期受阻。ClpXP和ClpCP作为两种蛋白酶复合物,是枯草芽孢杆菌蛋白质质量控制系统的重要组成部分,参与体内降解蛋白质聚集物。从实验室前期的研究发现B.cereus中clpP基因缺失会造成Spx1蛋白的积累,而clpX基因缺失无任何影响,推测clpC基因缺失阻遏芽孢的形成可能是由于Spx1蛋白积累。为了证明这种推测,构建双敲除菌株ΔclpCΔspx1,测定野生型菌株和突变菌株的生物性状。结果发现ΔclpCΔspx1的菌落形态,运动能力,芽孢产生和产胞外蛋白酶的能力均恢复至野生型0-9的水平,表明clpC基因缺失后造成的菌落形态差异,芽孢形成缺陷,运动能力和产蛋白酶能力下降,是因为基因spx1表达过量造成的,验证了spx1调节因子是由ClpCP蛋白复合物调控的推测。