论文部分内容阅读
miRNA是一类长度约为21-23 nt的调控性小分子RNA,具有高度的保守性、时序性和组织特异性,在生物生长发育、分化和疾病等方面都发挥重要作用。目前,在真菌内发现了类似miRNA的真菌小RNA（MicroRNA-likeRNA,milRNAs）。milRNAs可通过调控病原菌与寄主内相关基因的表达,从而在真菌的发育、致病和宿主的免疫等过程中发挥重要作用。微孢子虫（Microsporidia）是一类专性细胞内寄生的真菌类病原微生物,能够广泛的感染无脊椎动物和脊椎动物。家蚕微孢子虫（Nosema bombycis,N.b）是第一个被发现的微孢子虫,可作为微孢子虫的代表种,其引发的家蚕微粒子病严重威胁着蚕业生产的可持续发展,由于其独特的致病机理,也可作为研究寄生类真菌的模式生物。通过对家蚕微孢子虫milRNA及其功能的研究,可为家蚕微孢子虫milRNA的研究奠定基础,也为解析家蚕微孢子虫的侵染机制和病害防控提供参考。鉴于此,我们通过深度测序预测了家蚕微孢子虫milRNAs,对milRNA-8的表达特征和功能进行了研究,并通过预测milRNA的靶基因,初步解析了milRNA-8调控家蚕微孢子虫的增殖机制。论文取得的研究结果如下:1.家蚕微孢子虫milRNAs的预测和分析为了预测家蚕微孢子虫的milRNAs,本研究通过荧光显微镜观察和q PCR检测对家蚕微孢子虫的生活史进行分析,结果显示家蚕微孢子虫在48 h的裂殖增殖期时,尚未形成完整的孢壳,是微孢子虫milRNAs最丰富的时期,故选择48 h的家蚕微孢子虫进行milRNA测序。通过milRNA测序对得到的家蚕微孢子虫sRNAs进行长度筛选、基因组比对和milRNAs二级结构分析,共预测到的11个家蚕微孢子milRNAs。采用stem-loop q RT-PCR对其表达量进行验证,结果显示有10个milRNAs的表达水平与测序预测趋势一致,均在微孢子虫感染后特异高表达。以上研究结果表明,在家蚕微孢子虫48 h裂殖增殖期预测的10个milRNAs较为可靠,可进行后续研究。2.家蚕微孢子虫milRNA-8的鉴定和功能分析为了分析家蚕微孢子虫milRNAs的功能,本研究成功构建7个milRNAs过表达载体,在细胞水平转染后,利用q PCR检测家蚕微孢子虫的拷贝数,结果显示milRNA-4、milRNA-8、milRNA-10和milRNA-12对N.b的增殖有促进作用,milRNA-1、milRNA-3和milRNA-11对N.b的增殖有抑制作用,其中milRNA-8对N.b的促进作用最显著,故以milRNA-8为研究对象进行后续研究。为分析milRNA-8的表达特征进行,我们通过stem-loop q RT-PCR对milRNA-8的表达水平进行分析,结果表明家蚕细胞感染N.b后,milRNA-8的表达量呈上升趋势;进一步对milRNA-8设计特异的荧光探针,采用荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）发现,milRNA-8在微孢子虫的孢原质和宿主的细胞质内表达。为进一步探究milRNA-8的功能,在细胞水平添加milRNA-8 inhibitor后,通过q PCR检测家蚕微孢子虫的拷贝数,结果显示N.b的增殖受到了抑制。以上研究表明,milRNA-8对N.b的增殖有重要的调控作用。3.家蚕微孢子虫milRNA-8靶基因的筛选与鉴定为进一步探究milRNA-8对N.b增殖的调控机制,我们对milRNA-8在宿主内的靶基因进行预测,共预测到569个候选基因,选取其中表达水平的差异倍数≥2的64个候选基因进行研究。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and genomes,KEGG）分析发现这些基因主要富集于新陈代谢类、神经活性受体--配体类和过氧化物酶体通路。此外,利用q RT-PCR对候选基因的表达水平进行检测,发现过表达milRNA-8后,家蚕过氧化物酶膜蛋白基因16（Bombyx mori peroxisomal membrane protein 16,BmPEX16）的表达水平受到显著抑制。基于以上对候选基因的功能和表达水平的分析,我们选择了其中涉及过氧化物酶体生物形成的BmPEX16进行深入研究。为了验证milRNA-8与BmPEX16的结合作用,除对结合位点进行分析外,利用双荧光素酶报告实验检测发现,将BmPEX16 3’UTR部分序列与milRNA-8过表达载体共转后,实验组荧光素酶活性降低。为了分析BmPEX16的基因特征,通过序列比对分析,发现BmPEX16与鳞翅目类、双翅目类具有较高的序列保守性;q RT-PCR检测发现,其在大造5龄3天（5L3D）的血液和中肠高表达,同时,在细胞水平上感染N.b后,发现其表达水平呈下降趋势。为进一步研究milRNA-8对BmPEX16的调控作用,添加milRNA-8 inhibitor后,通过q RT-PCR检测,BmPEX16的表达水平上调。以上研究结果表明,BmPEX16为milRNA-8的靶基因,其表达水平受到milRNA-8的调控。4.BmPEX16对家蚕微孢子虫增殖的影响为了探究BmPEX16对家蚕微孢子虫增殖的影响,我们构建了BmPEX16的过表达载体,q RT-PCR和Western Blotting检测发现,当BmPEX16表达量上调,对微孢子虫的增殖有抑制作用。此外,根据规律成簇的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）编辑系统的原理,设计并成功构建CRISPR/Cas13a编辑载体和ssg BmPEX16敲除载体,q RT-PCR和Western Blotting检测发现,当BmPEX16表达量下降时,对微孢子虫的增殖有显著的促进作用。以上研究表明,家蚕微孢子虫milRNA-8可通过下调宿主BmPEX16的表达水平,影响宿主的过氧化物酶体的形成,抑制宿主的先天免疫反应,有助于微孢子虫的入侵,从而促进自身增殖。