【摘 要】
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目的:1.探讨宫颈癌细胞中HPV16 E6和E7与程序性死亡受体配体-1（Programmed Death Receptor Ligand-1,PD-L1）蛋白的相关性;2.筛选在宫颈癌组织中差异表达的微小RNA（micro RNA,miRNA）;3.探索miR-497-5p靶向PD-L1的可能作用机制。方法:1.采用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）验证宫颈癌
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目的:1.探讨宫颈癌细胞中HPV16 E6和E7与程序性死亡受体配体-1（Programmed Death Receptor Ligand-1,PD-L1）蛋白的相关性;2.筛选在宫颈癌组织中差异表达的微小RNA（micro RNA,miRNA）;3.探索miR-497-5p靶向PD-L1的可能作用机制。方法:1.采用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）验证宫颈癌细胞中HPV16 E6和E7蛋白对PD-L1蛋白是否有直接作用;2.通过生信分析筛选在宫颈癌组织中差异表达的miRNA;基于TCGA的宫颈癌数据探索miRNA与预后的关系;3.E6、E7 si RNA由上海吉玛制药技术有限公司的设计合成,通过脂质体在HPV16阳性宫颈癌细胞株中转染E6、E7 si RNA,下调E6、E7的表达;构建E6、E7基因表达质粒（E6、E7、E6E7 expression plasmid,E6-p、E7-p、E6E7-p）,在HPV阴性宫颈癌细胞株中表达E6、E7。q RT-PCR检测不同组细胞表达miRNA的情况;4.miR-497-5p mimics和inhibitor转染HPV16阳性宫颈癌细胞株,并通过Western blot检测各组PD-L1蛋白的表达情况;5.通过预测软件,寻找PD-L1 m RNA 3’UTR上miR-497-5p的作用靶点;6.采用双荧光素酶报告实验验证miR-497-5p是否与PD-L1 m RNA 3’UTR靶向结合。结果:1.Co-IP实验验证HPV16 E6和E7对PD-L1无直接作用关系;2.通过对GSE86100基因芯片中宫颈癌HPV阳性样本和HPV阴性样本之间比较,在HPV感染宫颈癌样本中86个miRNA低表达;同时,通过targetscan等软件在线分析,发现26个靶向调控PD-L1高表达的miRNA;上述两个数据交集中有4个miRNA;基于TCGA的宫颈癌临床数据分析发现,仅hsa-miR-497-5p高表达的患者预后较好;3.通过在宫颈癌细胞中上调和下调E6、E7表达后,发现E6、E7与hsamiR-497-5p表达呈负性调控关系;4.miR-497-5p mimics和inhibitor转染HPV16阳性宫颈癌细胞株,结果显示,hsa-miR-497-5p能抑制PD-L1蛋白的表达水平;而hsa-miR-497-5p inbibitor能提升PD-L1蛋白的表达水平;5.通过targetscan数据库,预测得到miR-497-5p靶向PD-L1（CD274）m RNA的3’UTR区的结合位点;6.双荧光素酶活性实验结果提示miR-497-5p可以靶向结合PD-L1的3’-UTR序列。结论:HPV16 E6E7可能通过miR-497-5P/PD-L1轴促进宫颈癌细胞免疫逃逸。
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