【摘 要】
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作为一种简单的信号分子,NO广泛存在于各生物体组织中。NO非常活跃的氧化还原特性,赋予它独特、重要的生理功能。NO可以与蛋白质特定位点的半胱氨酸上的巯基残基特异性地共价结
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作为一种简单的信号分子,NO广泛存在于各生物体组织中。NO非常活跃的氧化还原特性,赋予它独特、重要的生理功能。NO可以与蛋白质特定位点的半胱氨酸上的巯基残基特异性地共价结合,发生S-亚硝基化修饰作用,得到亚硝基硫醇,进一步调节目标蛋白质的结构和活性,这对于拓展NO信号转导途径有重要的意义。本文以肥城桃为实验材料,通过生物分析方法研究了NO对体外重组表达得到的山梨醇脱氢酶活性的影响,探讨了S-亚硝基化修饰作用在山梨醇脱氢酶活性调节过程中发挥的重要作用,利用定点突变技术改变酶活性中心结构,进一步提出了NO抑制山梨醇脱氢酶活性的分子机理。研究发现:在植物体内GSH/GSNO共同调节桃果实山梨醇脱氢酶活性的变化,生物体内NO含量在短时间内积累达到最大,还原性小分子GSH结合NO得到GSNO,然后改巯基与GSNO发生转亚硝基化反应,释放出Zn2+离子,使得SDH活性降低;当体内GSNO浓度降低到一定程度上,还原性试剂可以将RSNO还原释放出巯基,在结合Zn2+离子,从而调节SDH活性。目前多数生物学检测亚硝基硫醇的方法实验周期长,所需实验仪器和试剂较为昂贵,无法更迅速高效地对S-亚硝基化现象进行检测分析。表面等离子体共振技术因其无需标记、耗时少、高灵敏等优点能够实时、在线检测生物大分子间的相互作用。因此,将表面等离子体共技术与传统的生物检测方法相结合,建立新型的检测亚硝基硫醇的方法。本文通过构建自组装分子生物层,以巯基烷酸为基底,利用生物素-亲和素特异性结合的特点,将蛋白质固定到裸金片表面,进而对蛋白底物进行特异性检测,结果表明:蛋白底物浓度在0.1-1mg ml-1时,检测线性最好,R=0.998,且该自组装分子生物层能够特异性地检测蛋白的亚硝基化修饰。
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