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第一部分组织激肽释放酶对糖尿病脑缺血再灌注损伤的影响目的:缺血性脑卒中是一种严重威胁人类生命健康的脑血管疾病,糖尿病（diabetes mellitus,DM）作为一种慢性炎症性疾病,不仅能加重缺血性脑卒中的损伤,也会影响脑卒中患者的预后。本研究旨在探究静脉给予组织激肽释放酶（tissue kallikrein,TK）能否减轻DM大鼠脑缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）急性期的损伤,从而发挥神经保护作用。方法:选用健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠,经高糖高脂饮食及低剂量链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）腹腔注射诱导形成DM大鼠,采用线栓法制作局灶性I/R模型。DM大鼠分为六组:假手术组、生理盐水对照组、TK治疗组、B1R拮抗剂（Lys-（des-Arg9-Leu8）-BK,300nmol/kg）联合 TK 治疗组、B2R 拮抗剂（bradyzide,1nmol/kg）联合TK治疗组、B1R+B2R拮抗剂联合TK治疗组。脑I/R即刻尾静脉给药,24 h后观察各组大鼠神经功能缺损评分（Neurological Severity Scores,NSS）,测定脑梗死体积百分比和脑水肿程度,判断TK对脑I/R损伤是否具有保护作用。为进一步探究TK对DM大鼠脑I/R后炎症反应的影响,采用免疫组化染色检测小胶质细胞离子钙接头蛋白（ionized calcium-binding adapter molecule 1,Iba1）及髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）染色阳性细胞数,并通过实时定量逆转录聚合酶链反应（real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）技术检测缺血半暗带区 TNF-α 及 IL-1β 的表达。采用 Fluoro-Jade C、TUNEL 及 Cleaved caspase-3染色检测神经元的变性和凋亡。结果:与生理盐水组相比,TK治疗组神经功能缺损评分、梗死体积百分比、脑水肿程度、凋亡及变性神经元数目、炎性因子表达及炎性细胞浸润均显著降低。提前给予B1R拮抗剂可使梗死体积、局部炎症反应以及细胞凋亡进一步减轻;相反,B2R拮抗剂预处理的大鼠神经功能缺损、脑水肿程度、梗死体积、局部炎症反应以及细胞凋亡程度显著恶化。结论:TK通过激活B2R,减轻DM大鼠脑I/R急性期的炎症反应,抑制细胞凋亡,从而减轻脑I/R损伤。第二部分 组织激肽释放酶对糖尿病脑缺血再灌注损伤发挥神经保护作用的细胞内信号机制目的:观察TK对DM脑I/R损伤后细胞内信号通路ERK1/2及CREB磷酸化的影响,探索TK保护作用可能涉及的细胞内信号通路。方法:1、采用Western blot检测DM大鼠脑I/R后0h、1h、3h、6h和24h磷酸化ERK1/2（phosphor-ERK1/2,p-ERK1/2）和总 ERK1/2（total-ERK1/2,t-ERK1/2）、磷酸化 CREB（phosphor-CREB,p-CREB）和总 CREB（total-CREB,t-CREB）的表达水平,并测定第一部分6组大鼠缺血半暗带脑组织ERK1/2、CREB及下游凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。2、DM大鼠随机分为5组:生理盐水组、TK治疗组、DMSO处理组、U0126处理组、U0126联合TK处理组。脑I/R即刻尾静脉给药,再灌注24h时评估神经功能缺损程度,测定脑水肿程度,观察脑梗死体积,检测神经元变性和凋亡,观察炎症反应。并采用Western blot定量检测,观察TK及ERK1/2通路阻断剂U0126对ERK1/2、CREB、Bcl-2以及Bax表达的影响。结果:1、DM大鼠脑I/R 1hp-ERK1/2和p-CREB表达达到高峰;与生理盐水组相比,TK治疗组p-ERK1/2、p-CREB、Bcl-2的水平均显著上调,而Bax表达下调。提前给予B1R拮抗剂可进一步提高p-CREB、Bcl-2的表达水平,并显著抑制Bax的表达;相反,B2R拮抗剂预处理的大鼠,p-ERK1/2、p-CREB、Bcl-2的表达均显著下调,而Bax表达上调。2、相比生理盐水组,脑I/R 24h时ERK1/2抑制剂U0126完全抑制ERK1/2和CREB的磷酸化和Bcl-2的激活,同时促进Bax的激活;U0126组大鼠的神经功能缺损、脑梗死体积、脑水肿程度、局部炎症反应以及细胞凋亡均明显加重。U0126预处理部分消除TK的神经保护作用。这提示TK激活B2R而产生的神经保护作用至少一定程度上通过ERK1/2信号通路的磷酸化而发挥作用。结论:TK通过激活B2R-ERK1/2-CREB-Bcl-2信号通路减轻局部炎症反应介导损伤并抑制细胞凋亡可能是对DM大鼠脑I/R损伤发挥保护作用的机制之一。