前言移植肾急性排斥是肾移植术后最常见的并发症，可直接导致移植肾功能丢失或影响移植肾的长期存活。也有研究表明，持续存在的亚临床排斥是慢性移植肾肾病的危险因素，影响移植肾的长期存活。所有这些诊断的金标准是肾组织活检，是一创伤性的检查，并收到取样限制。很多研究采用各种实验方法从mRNA水平，蛋白水平和细胞功能等层面去寻找急性排斥的生物标志物，评价移植肾功能，阐释急性排斥的发病机制，取得了一定的进展。移植肾急性排斥是T细胞介导的同种异体免疫反应，是一复杂的病理生理过程，有很多的基因参与，在免疫应答的过程中，可能伴有上千种基因的表达变化，并且各个基因之间相互影响，形成一个复杂的基因调控网络系统。很难利用单个生物标志物来诊断急性排斥，全面反映移植肾功能状态。客观上需要我们从整体、机体系统的水平来理解和解释。随着人类基因组计划的完成，高通量生物技术的发展和多学科的交叉融合使得从系统生物学角度来检测、阐释疾病的发生、发展变成了可能。日趋成熟的基因芯片技术和发展中的蛋白组学技术从基因转录水平和蛋白水平研究移植肾急性排斥，显示了良好的研究价值和应用前景。代谢组学是转录组学和蛋白组学的下游研究，代谢组分的变化是机体对疾病影响的最终应答反应。从某种程度上来讲，mRNA和蛋白质的变化告诉了我们可能即将要发生的事件，而代谢物水平则是告诉了已经发生的生物事件。因此代谢组学是对一个生物系统进行全面认识的不可缺少的一部分，也是系统生物学的一个重要组成部分。本课题试图通过分析肾移植受者mRNA，蛋白质和代谢物水平的变异，从整体的、系统的水平反应移植受者的免疫状态，最终联合多个生物标志物来诊断急性排斥，评价移植肾功能。第一部分肾移植受者外周血单个核细胞和肾组织的基因表达谱分析目的制备免疫相关基因芯片，分析移植受者外周血单个核细胞和肾组织的基因表达谱，用于诊断移植肾功能障碍，理解排斥的发生机理。方法根据移植免疫学知识和参考现有文献筛选了免疫相关基因449个，预先合成寡核苷酸再点样的方法制备基因芯片。分析了15例肾功能稳定者(TX)，15例急性排斥(AR)包括6例C4d+急性体液性排斥(C4d+AHR)和9例C4d-急性细胞性排斥(C4d-ACR)，11例临界改变(BL)，5例急性肾小管坏死(ATN)，9例假定排斥(PR)和7例非排斥(NR)者的外周血单个核细胞(PBMC)的基因表达谱。同时分析了10例肾功能稳定者，16例急性排斥，5例急性肾小管坏死和21例供肾的肾组织基因表达谱。采用程序CyberT检验筛选差异表达基因(P＜0.01，上调或下调2倍以上认为有显著差异)，EPCLUST软件对芯片表达数据进行表达谱的聚类分析。并用定量PCR技术验证芯片筛选出的差异基因表达情况。结果制备的基因芯片具有良好的实验重复性。AR与TX比较，PBMC和肾组织的基因表达谱都发生了显著的变化，分别有63个和54个基因有显著差异表达。主要包括细胞交流和信号传导、信号转导、转录调控，凋亡相关和趋化活性的基因。定量PCR验证结果和芯片一致。聚类分析结果AR与TX聚成两大枝，能很好的区分开来。C4d+AHR与C4d-ACR的基因表达谱比较，筛选出7个基因在C4d+AHR表达显著上调。BL，ATN与TX组比较均筛选出一些差异表达基因，聚类分析能与TX组区分开来。PR，NR组的基因表达谱与TX组很接近，而与AR组基因表达差异显著。供肾组织基因表达谱分析发现筛选出的49个相关基因能够预测移植术后早期移植肾功能。结论制备的基因芯片可应用于肾移植受者基因表达谱的研究；可以应用于诊断移植肾急性肾功能障碍；筛选出了一些在急性排斥时被激活高表达的基因，这不仅有助于理解急性排斥的发生机制，也有可能成为急性排斥新的诊断指标。第二部分尿液蛋白质指纹图谱分析在移植肾功能诊断中的应用目的应用尿液蛋白质指纹图谱分析来建立排斥诊断模型，诊断急性排斥，C4d+体液性排斥和亚临床排斥。方法采用弱阳离子交换蛋白质芯片(CM10)和表面加强激光解析电离-飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)检测了36例肾功能稳定者(TX)，10例急性肾小管坏死(ATN)，55例急性排斥(AR)包括25例C4d+急性体液性排斥(C4d+AHR)和30例C4d-急性细胞性排斥(C4d-ACR)，37例亚临床排斥者(SCR)的尿液以得到蛋白质指纹图谱。支持向量机(SVM)来建立判断模型并用留一交叉验证来评估模型的准确率。数据分析采用ZUCIPDAS软件包分析。其中94例样本用于建立诊断模型，44例样本次日独立测试，验证诊断模型的准确性。结果3个蛋白质峰(2655Da，11730Da，13134Da)建立的ATN和TX的诊断模型，灵敏度和特异度均为100％。3个蛋白质峰(2364Da，66479Da，33344Da)建立的AR与TX的诊断模型，特异度和灵敏度分别为86.4％和85.7％。次日盲法独立测试，特异度和灵敏度分别为78.6％和100％。C4d+AHR与C4d-ACR利用5个蛋白质峰(68440Da，66421Da，3937Da，33322Da和8851Da)建立的诊断模型也很好区分开来，特异度和灵敏度为95％和80％。次日盲法独立测试，特异度和灵敏度为90％和80％。SCR和TX的诊断模型由4个蛋白质峰(2761Da,10762Da，11729Da和11940Da)组成，特异度和灵敏度分别为81.8％和81.5％。次日盲法独立测试，特异度和灵敏度分别为71.4％和90％。结论建立了AR，C4d+AHR和SCR的尿液蛋白质指纹图谱的诊断模型，提供了一种无创诊断AR，C4d+AHR和SCR的方法。第三部分移植肾急性排斥的血清代谢谱初步研究目的分析移植肾急性排斥患者血清代谢谱的变化，初步探索代谢组学分析在移植肾急性排斥研究中的意义。方法应用气相色谱-质谱(GC/MS)的方法检测了37例肾移植受者(22例病理证实的急性排斥患者和15例肾功能稳定者)的血清代谢谱。原始数据经内标校正，对数转化和归一化处理后，采用cyber-T检验比较两组间代谢物含量的差异，并用主成分分析、聚类分析的方法分析两组间代谢谱的差异。结果两组间一般临床资料(性别，年龄，原发病，HLA错配，PRA，体重指数等)均无统计学差异。最终鉴定出46个代谢物，包括糖类，脂质，氨基酸和其他类型代谢物如肌醇、甘油、尿素和氨基丁烷。其中17个代谢物包括氨基酸类(苯丙氨酸，苏氨酸，丝氨酸，缬氨酸，甘氨酸)，糖类(半乳糖，葡萄糖，果糖)，羧酸，脂质和其它类代谢物乳酸，尿素和肌醇在急性排斥组中含量显著高于肾功能稳定组。丙氨酸，赖氨酸，亮氨酸，丙二酸和十二烷酸在肾功能稳定组中含量显著高于急性排斥组。46个代谢物的主成分分析图示肾功能稳定组和急性排斥组能很好区分开来。聚类分析结果也能很好的把急性排斥组与肾功能稳定组区分开来，判断急性排斥的灵敏度为77.3％，特异度为100％。结论急性排斥患者与肾功能稳定者的血清代谢谱有显著性差异，大部分测定的代谢物为细胞内参与能量代谢过程。提示血清中代谢物水平能反应移植肾功能状态。血清代谢组分析有可能为移植肾急性排斥提供新的诊断指标。