论文部分内容阅读
防御素是近年来发现的具有广谱抗菌活性并在机体抵御外来微生物入侵时起防御作用的一类阳离子小分子多肽。人防御素有着较强的抗菌活性和广泛的抗菌谱。防御素相对于当前广泛使用的抗生素而言,对人体毒副作用小,而且其独特的抗菌机理使其不易产生抗药性。目前从多种生物中都发现了防御素。海鞘抗菌肽Clavanins是从海鞘中发现的一类抗菌活性小肽。ClavE是其中的一个,有在不同pH值表现出不同抗菌机制的特点,且其抑菌活性受环境pH影响较小。而人防御素则大多具有pH值依赖性,在一定pH值下会失活。本研究旨在通过基因工程的方法,对海鞘抗菌肽ClavE与人防御素HD-5、HBD-2和HBD-3进行重组表达,同时为了将两种抗菌肽各自的优势特性结合,将ClavE和HD-5、HBD-2、HBD-3分别进行蛋白融合。通过基因重组,构建几种抗菌肽编码基因及几种融合蛋白编码基因的真核系统和原核系统的表达载体,分别在酵母和大肠杆菌中进行表达。通过对重组融合蛋白的抑菌活性与抑菌范围分析,以期获得稳定性较好且抑菌pH范围更广、抑菌能力更强的基因工程抗菌肽。经密码子优化,使用搭桥PCR方法,体外合成出了ClavE、HD-5、HBD-2,HBD-3几种多肽的编码DNA序列进行了重组,并获得了ClavE-HD-5, ClavE-HBD-2, ClavE-HBD-3三种蛋白融合的编码DNA序列。利用这些DNA序列共构建了七个真核表达载体：pVTl02U-α-HD5、pVT102U-α-HBD2、 pVT102U-α-HBD3、PVT102U-α-ClavE、pVT102U-α-ClavE-HD5、pVT102U-α-ClavE-HBD2、pVT102U-a-ClavE-HBD3,以及两个原核表达载体：pET30a-ClavE-HD5、pET30a-ClavE-HBD3.分别将真核表达载体和原核表达载体转化到酿酒酵母细胞和大肠杆菌Rosetta(DE3)中,获得了转化的表达细胞株,并开展了融合蛋白的表达。表达蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分析,在真核酿酒酵母表达系统中实现了ClavE、HD-5、HBD-2、HBD-3的表达,对HD-5、HBD-2、HBD-3三个蛋白进行了初步纯化,结合抑菌实验表明获得的抗菌肽蛋白均有抑菌活性,但产量相对较低；在原核Rosetta(DE3)菌株中实现了ClavE-HBD3和ClavE-HD5的诱导表达,可溶性分析结果表明两种表达融合蛋白均为包涵体形式,抗菌活性不显著。本研究初步探讨了多种抗菌肽基因在真核酿酒酵母表达系统和原核Rosetta(DE3)表达系统中的表达情况,及表达产物抗菌活性的初步检测,为后续各种防御素及融合防御素的重组表达、活性检测和开发利用奠定了基础。