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近年来纤维素利用出现了崭新途径—纤维素转化为可以食用的淀粉,考虑到目前世界粮食安全形势,纤维素转淀粉的现实意义深远而巨大。然而现有的体外酶法纤维素转淀粉体系受制于淀粉合成步骤中的纤维二糖磷酸化酶(CBP)和葡聚糖磷酸化酶(PGP),这两个酶来源单一,催化效率有限严重制约了转淀粉体系的实际生产应用。考虑到CBP、PGP已经是经过大量筛选得到的较为优良的酶,并且两个酶是顺次反应的关系,因此本研究期望通过构建CBP-PGP的人工多酶复合体、融合酶两种方式来实现酶组合的高度协同作用—底物穿梭效应,提高体系转化效率。本研究得到的主要结果有:(1)在人工多酶复合体策略构建底物穿梭体研究中,首先将PDZ(D1)、GBD(D2)、SH3(D3)通过柔性的连接肽(F)连接到CBP的C端,构建了CBP-D1、CBP-D2、CBP-D3。将与蛋白域对应的肽配体(L1、L2、L3)通过柔性的连接肽连接到PGP的C端,构建PGP-L1、PGP-L2、PGP-L3。测定最适p H、最适温度、半失活时间、比活力后发现:CBP-D1、CBP-D2、CBP-D3的酶学性质受到了严重影响,其中CBP-D3相对较优,但相对活力为0.0010μmol/min/mg,与野生酶0.0287μmol/min/mg的比活力相比仍相差较大;同理构建的PGP-L1、PGP-L2、PGP-L3中PGP-L3为最优融合酶,其相对活力为0.0137μmol/min/mg,与野生酶相比相差不大。然而将CBP-D3、PGP-L3进行体外转淀粉实验未见淀粉的生成。(2)由于蛋白域对CBP影响严重,因此又将分子量较小的肽配体通过柔性连接肽融合到CBP上,构建CBP-L1、CBP-L2、CBP-L3,期望选出对CBP无影响的肽配体。测定最适p H、最适温度、半失活时间、比活力后发现:CBP-L1、CBP-L2、CBP-L3的酶学性质仍受到严重影响,其中CBP-L1是相对最优,相对活力为0.0002μmol/min/mg,与野生酶0.0287μmol/min/mg的比活力相比,仍相差较大。将CBP-L1、PGP进行体外转淀粉实验也未见淀粉的生成。使用刚性连接肽R1、R2以及来自于R.flavefaciens的连接肽Rf构建了CBP-R1-L1、CBP-R2-L1、CBP-Rf-L1,期望通过改变连接肽提高融合酶活力,通过测定最适p H、最适温度、半失活时间、比活力后发现:CBP-R1-L1、CBP-R-2L2、CBP-Rf-L3酶学性质仍无法改善,其中使用R1构建的CBP-R1-L1相对最优,相对活力为0.0012μmol/min/mg,与野生酶0.0287μmol/min/mg的比活力相比仍相差较大。将CBP-L1、PGP进行体外转淀粉实验也未见淀粉的生成,使用R1构建的CBP-R1-L1相对其他连接肽是较为适合CBP的。(3)通过柔性连接肽构建了CBP在N端,PGP在C端的融合酶CBP-PGP,以及PGP在N端,CBP在C端的PGP-CBP两种形式的融合酶。检测粗酶性质后发现,CBP酶活方面:CBP-PGP、PGP-CBP的最适p H分别为7.5、6.5,最适温度分别为45、60,半失活时间分别为5min、30min。PGP酶活方面:CBP-PGP、PGP-CBP的最适p H分别为7.5、5.5,最适温度分别为30℃、35℃,半失活时间分别为2min、14min。于是对PGP-CBP进行纯化,测得PGP-CBP的纤维二糖磷酸化酶比活力为0.0258μmol/min/mg,与CBP相比只下降了10%,葡聚糖磷酸化酶比活力为0.0097μmol/min/mg,与PGP相比下降了51%,拥有CBP和PGP双酶活。相同摩尔浓度的转淀粉反应体系下,PGP-CBP的转淀粉率为12.79%,CBP、PGP游离酶的转淀粉率为16.84%。通过检测G-1-P以及引入PGM竞争中间产物的方法测定了PGP-CBP的底物穿梭效应,其中加入200u的PGM反应16h后PGP-CBP融合酶体系总催化活力只下降了1.58%。本论文针对限制纤维素转淀粉体系的两个关键酶—CBP、PGP,通过构建人工多酶复合体、融合酶等方法以期提高体系的转化效率,解决当下日益紧张的粮食安全形势。实验探究了连接肽类型、蛋白域-肽配体类型对CBP的影响,证明了刚性连接肽对构建融合酶的优点。虽然采用的第一种策略无法实现底物穿梭,但是融合酶PGP-CBP显示出了较高的CBP活性和PGP活性,淀粉转化率也与游离酶差别不大。PGP-CBP实现了底物穿梭,为纤维素转淀粉的实际生产应用提供了可能,有利于目前缓解日益紧张的粮食安全问题。