临床蛋白质组学的主要研究目标是识别生物体液中的疾病生物标志物,进而对疾病进行早期诊断。尿液中蛋白种类和数量的变化不仅可以反映肾脏、膀胱等整个泌尿系统的状况,还可以反应机体的整体变化。研究蛋白质磷酸化也对了解人类疾病的发生发展过程有重大意义。本论文,使用串联超滤法对尿液中的游离蛋白和外泌体进行提取,将提取到的蛋白酶解后,使用二氧化钛对磷酸化的肽段进行富集,最后使用液相色谱-质谱联用对富集到的磷酸化肽段进行鉴定。实验中,使用100 KD-30 KD串联超滤管先后截留尿液中的外泌体和游离的尿蛋白,从而实现对正常人同一批次尿液中的外泌体和游离尿蛋白相继分离。分别使用电子显微镜和“蛋白质免疫印迹”技术对所提取的外泌体进行表征,结果显示,其结构与尺寸分布均符合外泌体特征,外泌体膜上的特异性蛋白TSG101及AQP2均为阳性。分别使用串联超滤法和传统的丙酮沉淀法提取尿液中外加的荧光素标记蛋白,结果显示,串联超滤法对游离尿蛋白的提取率较高。本方法每次提取周期仅需2 h,低于传统丙酮沉淀技术的6 h。此外,通过6组超滤管同时离心可实现多达6个不同的尿液样品中尿蛋白和外泌体的提取,极大的缩短提取时间。将串联超滤法所分离到的尿蛋白和外泌体酶切成肽段,使用二氧化钛富集尿蛋白和外泌体的磷酸化肽段,运用液相色谱-质谱联用技术进行鉴定以及Mascot搜索引擎对质谱数据进行检索。Mascot检索结果表明,二氧化钛对尿液中尿蛋白磷酸化肽段的富集效率为62.3%,对外泌体磷酸化肽段的富集效率可达87%。尿蛋白中鉴定到了 463个磷酸化蛋白,568个磷酸化肽段和1025个磷酸化位点;尿液外泌体中鉴定到989个磷酸化蛋白,1635个磷酸化肽段和2010个磷酸化位点。串联超滤法为尿液中蛋白质的提取提供了一种快速、高效、平行且绿色的新方法,经过二氧化钛富集后,液相色谱-质谱法也检测出数量较高的磷酸化蛋白。