研究背景遗传病分为染色体病、单基因病、多基因病及线粒体病。遗传病种类繁多,临床表现不典型,尤其再新生儿时期更不典型,且多数属于危重症,预后差,不仅临床诊断不容易,救治难度也相当大。是婴幼儿期或围生期患儿死亡的重要原因,且遗传病患儿数量呈逐年上升趋势。然而传统细胞遗传性技术根本无法精准检测基因突变。85%的人类致病基因变异发生于外显子区。全外显子组测序（whole exome sequencing,WES）可以精准地检测覆盖范围内的绝大多数（约98%）点突变,以及大多数的拷贝数变异。WES能高效快速地确定致病基因及突变位点,有助于快速筛选遗传性疾病。目的通过搜集近3年入住我院的疑似遗传病或诊断不明确的危重新生儿的临床资料,探讨全外显子组测序（WES）技术在危重新生儿遗传病中的应用价值。材料与方法1研究对象研究对象为2018年1月至2020年6月入住中山市人民医院新生儿重症监护室的危重新生儿,疑似遗传病或诊断不明确的新生儿。共纳入研究的新生儿有66例,其中男34例（52%）,女32例（48%）,胎龄28周+1～41周+3,出生体重0.97kg～3.9kg,发病年龄1d～28 d。临床表现患儿均在新生儿期发病,主要临床表现及辅助检查阳性结果有:黄疸持续不退、胆汁淤积13例,喂养困难4例,反复抽搐4例,皮肤异常7例,肌张力异常3例,不明原因呼吸困难3例,内脏异位1例,巨舌1例,口腔及外观畸形14例,心脏结构严重异常3例,血或尿串联质谱遗传代谢病筛查结果异常7例,胎儿期染色体异常1例,反复低血糖及代谢性酸中毒3例,反复全血三系减少2例。医学伦理学审批本研究获得中山市人民医院医学伦理委员会审批同意。新生儿监护人均签署知情同意书。填写患儿及其父母的基本信息、临床表现及相关辅助检查结果。2方法2.1研究对象筛选纳入标准:（1）根据临床症状、体征及其它辅助检查,高度怀疑遗传病患儿,或其有阳性家族史、近亲结婚家系;（2）临床诊断明确且该疾病遗传特异性高或患儿表型为非特异性。排除标准:（1）已达到纳入标准,但患儿监护人签字不同意者;（2）目标疾病致病基因不在WES检测范围。2.2标本采集采集患儿及其父母的静脉血2～3 m L,EDTA/柠檬酸盐抗凝,于2～8℃环境中冷藏保存。填写患儿及其父母的基本信息、临床表现及相关辅助检查结果,将标本快递至广州金域医学检验中心进行高通量WES检测。2.3检测方法2.3.1 WES血标本冷藏送达检验中心后,用QIAamp DNA Mini KIT试剂提取外周血DNA,用酶切方法片段化g DNA,将特异序列的接头加在片段化的DNA上,IDT厂家生产的x Gen Exome Research panel v1捕获探针捕获出目标基因,由Illumina厂家生产的Next Seq 500二代测序仪对全外显子组进行测序。2.3.2验证经WES检测出的基因变异位点及父母相关基因位点进行一代Sanger测序加以验证。2.3.3数据库比对采用十分庞大的数据作为对照,其中包含了国外多个人群的数据和大量中国人群的数据。金域实验室采用的突变/变异数据库主要包括:金域数据库,以中国人遗传病患者为主;人类基因突变数据库（HGMD,专业版）,以病人为主的变异数据库;Clin Var数据库（综合性）,与疾病相关的人类基因组变异数据库;ESP6500数据库（美国国家心脏、肺和血液研究所外显子组测序计划）,以一般人群为主,主要用于心、肺、血液相关疾病的研究;G1000数据库（千人基因组计划）,以一般人群为主;单核苷酸多态性数据库（db SNP）,以一般人群为主,是单碱基替换及短插入、删除多态性的资源库。2.3.4解读对所检测到的基因变异从多个方面进行综合分析,评估其是否有临床意义。临床医生结合患儿的临床表型及WES检测结果进行综合分析解读,参考2016年第2版美国医学遗传学和基因组学会（ACMG）指南,给出最后报告。致病性基因变异:指特定病人携带的引起了疾病状态的病理性变异。可疑致病性基因变异:指很可能具有致病倾向的变异,但证据尚不充分。临床意义未明的变异:为目前没有报道,无相关数据库表明其临床意义,但未来在临床过程中可能有意义;且临床意义未明的变异是否会引起患者的疾病,尚有待科学的发展、数据的积累及更深入的功能研究。2.4其他辅助检查血常规、尿常规、肝肾功能、血糖、血气分析、血氨、血乳酸、胰岛素、同型半胱氨酸、串联质谱、X片、心脏彩超、头颅MRI、脑电图等。结果1一般情况纳入研究的新生儿患者共有66例,其中男34例（52%）,女32例（48%）,发病年龄1～28 d,确诊为基因遗传病的新生儿有15例（阳性率23%）,其中男11例,女4例,平均确诊年龄为（37±9）d。2临床资料66例患儿经WES检测出有基因变异14例,阳性率为21.21%;1例患儿经WES检测未见有基因变异,但因临床表现高度怀疑为色素失禁症,联合多重连接酶探针依赖扩增技术检测出基因变异。根据检测出的基因变异位点与疾病的相关性,结合一代Sanger测序加以验证,再辅以Clin Var数据库、OMIM数据库、基因编码蛋白的结构域分析、家族史、大样本量调查所获得的变异频率及生物信息学软件对某些变异位点的分析结果进行评估,临床医生结合患儿的表型及WES检测结果综合分析解读,最终确诊为基因遗传病患儿有15例。主要临床诊断存在皮肤、颅骨及神经遗传病5例;存在内分泌和代谢系统疾病7例;心血管系统疾病2例;染色体病1例。15例确诊基因遗传病患儿中有13例行染色体检查,其中只有1例染色体异常,其余12例染色体检查无异常。3基因遗传病患儿的基因突变信息在基因遗传病患儿基因变异分类中,致病性基因变异10例,占67%（10/15）;可疑致病性基因变异1例,占7%（1/15）;基因变异意义未明4例,27%（4/15）。其中有1例患儿WES检测未见有致病性基因,因临床表现高度怀疑为色素失禁症,再应用多重连接酶探针依赖扩增技术,检测样本特定基因的各个外显子,检测到IKBKG基因4～10号外显子的杂合缺失突变（表1）。在含有致病性基因变异的10例患儿中,常染色体隐性遗传病4例（40%）,常染色体显性遗传病3例（30%）,X-连锁显性遗传病1例（10%）,基因片段缺失2例（20%）。其中有3例常染色体隐性遗传病患儿父母均杂合携带致病基因;2例常染色体显性遗传病患儿父母不携带致病基因,该变异可能为新发变异,同时不排除其父母为生殖细胞嵌合型携带者的可能;另5例患儿父母未做相应基因检查,无法进一步验证患儿致病性变异基因的来源。结论1、WES检测技术是寻找疑似或诊断不明的危重新生儿遗传病的重要工具;2、WES技术有一定的局限性,联合其他测序方法可以提高检测阳性率。