溶藻弧菌是一类革兰氏阴性短杆菌、无芽孢、可运动,具有极生鞭毛、分布广泛、且主要以海水环境居多。溶藻弧菌会导致大规模弧菌病,给水产养殖业造成严重的经济损失。因此,溶藻弧菌的致病性引起了国内外专家的广泛研究。Ⅱ型分泌系统(T2S)广泛存在于革兰氏阴性细菌中,包括人类、动物和植物病原细菌。它是革兰氏阴性菌中的常规代谢途径,向细胞外分泌各种蛋白,包括胞外酶、蛋白酶、毒素和毒性因子,这些胞外蛋白毒性因子通常破坏寄主细胞,引起组织坏死和病害。rpoS是细菌一般胁迫反应的重要调控因子,当细菌经历逆境胁迫,如:碳源或氮源饥饿、渗透压增高、低pH、温度升高等都可以诱导RpoS的表达。大量的环境以及细胞内信号参与rpoS的调控,这些调控可以发生在转录水平、翻译水平、降解过程以及活性调节等方面,最终构成一个复杂且精致的调控网络,rpoS基因是一个全局性调控因子,在病原菌的抗逆作用中也发挥重要作用。在本次实验中采用基因沉默,qRT-PCR以及体外粘附试验的方式探究溶藻弧菌的粘附与II型分泌系统中基因(secA,secD,secF,yajC和yidC)的关系。结果显示,目的基因的表达量与粘附能力都在瞬时沉默与稳定沉默后表现出显著下调。瞬时沉默之后,在第3h,secA下调2.69-倍,secD下调8.61-倍secF下调3.13-倍,yajC下调2.16-倍,yidC下调4.51-倍。对照组每个视野约为1349±76个,然而secA,secD,secF,yajC和yidC实验组每个视野约有424±41,525±34,312±44,338±32,283±50个细胞。稳定沉默后secA,secD,secF,yajC和yidC基因的表达水平分别下调了2.04-,1.46-,1.14-,2.78-和5.95-倍。与对照组的粘附相比,对照组每个视野约有1078±58个细胞,而secA,secD,secF,yajC和yidC实验组每个视野约有214±44,302±48,932±144,808±48和234±22个细胞。这些结果都显示出secA,secD,secF,yajC和yidC基因和溶藻弧菌的粘附密切相关。secA,secD,secF,yajC和yidC基因的表达量受到温度、盐度、pH和饥饿程度的显著影响。在温度为44℃时,5种基因的表达量达到最高;在盐度为3.5%时,5种基因的表达量最高;通过不同的PH进行实验处理,发现这五个目的基因的表达呈现出倒U型的趋势,当pH 7时,除了yidC基因,其它4个基因的表达水平达到顶点。推迟饥饿时间,每个基因的表达量均显著下调。这表明secA,secD,secF,yajC和yidC基因对于不同的环境因子都较为敏感,相同的环境胁迫也会导致不同基因不同的表达变化。因此环境因子可以通过secA,secD,secF,yajC和yidC基因的表达来影响溶藻弧菌的粘附作用。同时还对rpoS基因进行基因沉默,qRT-PCR实验,体外粘附试验,生长曲线的检测,溶血性实验,平板运动性实验,生物成膜实验。实验结果显示,稳定沉默后的目的基因的表达量相比野生型下调1.90-倍。对实验组与对照组分别进行体外粘附实验,结果表明,对照组每个视野约1078±58个细胞,而rpoS沉默株约有814±37个细胞。rpoS基因的表达量受到温度、盐度、pH和饥饿程度的影响显著。在44℃,rpoS基因表达量显著;在盐度为4.5%时,基因表达量最高;通过不同PH进行处理,基因的表达呈现出倒U型的趋势,基因在pH 7.0时表达水平达到最高。rpoS基因的表达水平随着饥饿时间的推移显著下降,这说明了基因对不同环境胁迫存在不同的反应,rpoS基因对环境因子的作用很敏感。对比于野生型,rpoS沉默菌株的生长曲线总体走势较低,在6.5h之前沉默株的生长速率较快,6.5h至稳定期野生型生长速率较快。溶血性也相比于溶藻弧菌野生株较为不敏感,野生型的溶血率是沉默株的4.23-倍,证明rpoS基因与溶藻弧菌的溶血性之间有内在的联系。生物成膜实验,沉默株成膜总体偏低,野生株是沉默株的1.32-倍。野生溶藻弧菌平板运动性实验强于rpoS沉默株,野生型溶藻弧菌的半径大于沉默株的半径。以上结果都都表明rpoS基因对于溶藻弧菌的溶血实验,成膜实验,生长水平以及运动情况都有密切的联系,参与其内部的调控。总之,本研究的结果表明Ⅱ型分泌系统和rpoS基因对于溶藻弧菌的表达具有重要的调控作用,缺失以上基因的溶藻弧菌表达量会显著下降,同时也表明了Ⅱ型分泌系统和rpoS基因对不同环境胁迫以及表型实验都是较为敏感的