【摘 要】
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酿酒酵母作为历史悠久的生活生产菌株,与人类的生产活动关系密切。由于其遗传背景清晰、易于培养、具有生物安全性等优点,广泛应用于高附加值代谢产物的生物合成。酪醇及其衍生物红景天苷因具有消炎、抗肿瘤、保护神经、保护心血管等医疗效用而需求量大增,生物合成因其绿色可持续的特性成为当前广受关注的研发重点。以酿酒酵母为底盘细胞合成酪醇及红景天苷衍生物取得了一定进展,但依然存在莽草酸途径碳流量水平低、E4P供应量
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酿酒酵母作为历史悠久的生活生产菌株,与人类的生产活动关系密切。由于其遗传背景清晰、易于培养、具有生物安全性等优点,广泛应用于高附加值代谢产物的生物合成。酪醇及其衍生物红景天苷因具有消炎、抗肿瘤、保护神经、保护心血管等医疗效用而需求量大增,生物合成因其绿色可持续的特性成为当前广受关注的研发重点。以酿酒酵母为底盘细胞合成酪醇及红景天苷衍生物取得了一定进展,但依然存在莽草酸途径碳流量水平低、E4P供应量不足、乙醇等副产物大量积累、UGT酶转化率和专一性低等关键技术瓶颈。针对以上关键技术瓶颈,本研究对底盘细胞进行了理性设计及代谢工程改造,以期获得高产酪醇和红景天苷酿酒酵母工程菌株本研究以课题组已经构建的酪醇生产菌株DA-1菌株为底盘细胞,首先解除芳香族氨基酸对酪醇生物合成途径关键酶的反馈抑制,在aro3位点导入芳香族氨基酸反馈抑制突变体ARO4K229L和ARO7G141S,获得DAY-1菌株的酪醇产量提高了 65.29%。敲除高糖酵解途径的转录激活因子Gcr2,菌株DAY-2-22的生长没有受到影响,但其酪醇产量也没有得到明显改善。在adh1位点上过表达ADH2,使得碳流量从乙醇逆转至莽草酸途经,引入ADH2后的转化子DAY-2-24的酪醇产量提高15.41%。为了减少芳香族氨基酸生物合成副产物的生成,选择在菌株DAY-1敲除邻氨基苯甲酸盐合成酶基因TRP3（DAY-2-26）与预苯酸脱水酶基因PHA2（DAY-2-27）,DAY-2-27的酪醇产量提高了49.08%,达到1.05±0.05 g/L。为了增加E4P的供应量,引入外源磷酸酮醇酶xfpk的E4P生成途径,在菌株DAY-1的pha2位点引入来自短双歧杆菌xfpk,摇瓶发酵96 h菌株DAY-2-29的酪醇产量提高了 107.87%,产量达到1.410±0.03 g/L,从头合成得率为0.49 mg酪醇/g葡萄糖/h。来自红景天的U8GT33酶经报道有较高的转化率,将RrU8GT33导入酪醇高产菌株DAY-2-29的trp3位点中获得红景天苷生成菌株DAY-3-2,摇瓶发酵96 h红景天苷产量达到2.77 g/L,从头合成得率为0.96 mg红景天苷/g葡萄糖/h。利用酿酒酵母表面系统“SSS盒”,尝试将U8GT33展示到菌株DAY-1细胞表面,将分泌到胞外的酪醇转化完全。摇瓶发酵结果显示,培养U8GT33表面展示菌株DAY-2-12时菌体易沉底,96 h生成1.25 g/L红景天苷,可见RrU8GT33展示到细胞表面依然保持较高的催化效率。
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