第一部分:mi R-210-3p和mi R-630抑制肺癌细胞增殖及其机制研究研究背景:尽管随着肺癌手术治疗、放化疗技术的不断进步,肺癌仍然是全世界范围内恶性肿瘤的首要死因,其极高发病率和低5年生存率的特征使肺癌成为严重威胁全世界人民生命健康安全的重大疾病。虽然很多与肺癌相关的重要癌基因和抑癌基因已被研究发现,但肺癌早期筛查、早期诊断的不成熟和肺癌患者临床传统治疗效果不理想还是导致肺癌发病率和死亡率居高不下。因此,研究探索肺癌发生、发展相关的关键基因和它们在肺癌发生发展中的相互作用功能网是提供肺癌早期筛查诊断和提高治疗效果的关键。Micro RNAs(mi RNAs)是一类内源性、高度保守、长度只有18-23bp的小片段RNA片段,是编码基因转录后调控的关键基因。大量研究表明,mi RNAs在肿瘤的发生、增殖、转移和侵袭方面均充当重要的调控角色。通过识别并与目的基因的短片段序列不完全互补配对结合,mi RNAs能沉默目的基因的表达,进而抑制靶基因的生物学功能。研究表明,mi R-210是肺癌诊断的一个敏感和特异的生物标志物。通过检测肺癌组织和血液中mi R-210的表达量可敏感地诊断早期阶段的非小细胞肺癌(non-small lung cancer,NSCLC),因此,有研究认为mi R-210在非小细胞肺癌患者中是一个小片段RNA癌基因。但是,也有一些研究揭示了mi R-210在一些肿瘤中通过调控癌细胞的增殖、细胞周期和凋亡发挥抑癌作用。综上所述,因缺乏充分的研究,现阶段还未能确定mi R-210在肺癌发展中所起的准确作用。mi R-630是另一个在肿瘤中功能未被明确研究的mi RNA。研究发现,通过充当一个顺铂药物的潜在调节器,mi R-630能在非小细胞肺癌患者顺铂药物治疗中调节顺铂药物诱导的肿瘤细胞死亡,并且在体外A549顺铂药物作用研究中发现,mi R-630能起细胞保护作用。相关研究还发现,mi R-630在人肺癌A549细胞凋亡过程中发挥双重作用。研究表明,mi R-630是肺癌患者药物治疗反应的重要调节基因,所以,深入研究mi R-630在人类肺癌细胞发展中发挥的功能就显得尤为重要。TAZ(Transcriptional co-activator with PDZ-binding motif,TAZ),又名WWTR1(WW-domain-containing transcription regulator 1,WWTR1),是Hippo信号通道下游的一个重要转录激活因子。研究表明,TAZ不仅在间质干细胞分化、胚胎干细胞自我更新以及与其他重要信号通路相互作用方面发挥重要调节作用,而且,在肿瘤形成、肿瘤细胞增值和凋亡方面扮演着重要的调节因子角色。相关研究发现,TAZ在非小细胞肺癌中作为癌基因在肺癌的发生中发挥重要作用;在体外细胞实验中表明,TAZ能促进肺癌细胞株生长增殖。其他研究还表明,TAZ表达水平往往与肺癌患者低生存率和肺癌发生转移密切相关。目的:1.通过肺癌细胞株中上调mi R-210-3p或mi R-630的表达,是否能抑制肺癌细胞的增值。2.通过肺癌细胞株中上调mi R-210-3p或mi R-630的表达,是否能促进肺癌细胞的凋亡,并且上调活化凋亡因子Caspase-3的表达。3.通过Target Scan在线预测mi R-210-3p和mi R-630的靶基因,遴选靶基因进一步通过双荧光素酶报告分析进行鉴定。4.通过鉴定发现TAZ是mi R-210-3p和mi R-630的共同靶基因,进一步验证,在肺癌细胞株中上调mi R-210-3p或mi R-630的表达,观察是否能导致TAZ表达量下调。5.通过肺癌细胞株中上调mi R-210-3p或mi R-630的表达,是否能影响TAZ上游调节基因MST和LATS的表达。方法:1.细胞株选择:人类肺癌细胞株包括肺鳞癌细胞株NCI-H2170和肺腺癌细胞株A549、NCI-H1299、HCC827;双荧光素酶报告分析选择293T.2.观察过表达的mi R-210-3p或mi R-630是否影响肺癌细胞的增值和凋亡:将mi R-210-3p或mi R-630转染入人类肺癌细胞株后,采用MTT检测细胞的生长情况,采用Annexin-V-FITC细胞凋亡检测细胞的凋亡情况并采用western blot检测细胞凋亡因子Caspase-3的表达。3.鉴定TAZ是否为mi R-210-3p或mi R-630调控的靶基因:mi RNAs靶基因在线预测软件Target Scan预测TAZ为mi R-210-3p和mi R-630的靶基因,并通过双荧光素酶分析鉴定。进一步验证,将mi R-210-3p或mi R-630转染入人类肺癌细胞株后,采用q RT-PCR和western blot检测TAZ的表达量。4.鉴定mi R-210-3p或mi R-630是否对TAZ的上游基因MST和LATS的表达有影响:将mi R-210-3p或mi R-630转染入人类肺癌细胞株后,采用q RT-PCR和western blot检测MST和LATS的表达。结果:1.MTT实验结果分析,转染了mi R-210-3p mimic或mi R-630 mimic的肺癌细胞株与对照组相比,细胞生长受到抑制或停滞。2.Annexin-V-FITC细胞凋亡检测结果显示,肺癌细胞株转染了mi R-210-3p mimic或mi R-630 mimic后,细胞出现明显的促凋亡现象。且western blot结果显示凋亡因子Caspase-3在转染了mi R-210-3p mimic或mi R-630 mimic的肺癌细胞株中表达量上调。3.Target Scan在线预测和双荧光素酶报告实验结果分析,发现TAZ是mi R-210-3p和mi R-630的共同靶基因。4.通过q RT-PCR和western blot结果分析,与对照组相比,上调mi R-210-3p或mi R-630表达的肺癌细胞株中TAZ的表达量明显降低。5.通过q RT-PCR和western blot结果分析,与对照组相比,随着mi R-210-3p或mi R-630表达量上调的肺癌细胞株中,TAZ上游基因MST和LATS表现的结果不尽相同,但总体来说有表达量上调的现象。结论:1.在肺癌细胞株中,mi R-210-3p和mi R-630能抑制细胞的生长并且促进细胞的凋亡,发挥抑癌作用。2.mi R-210-3p和mi R-630的抑癌机制是:可以通过靶作用癌基因TAZ,下调TAZ的表达,抑制TAZ的促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的功能;同时mi R-210-3p和mi R-630明显上调凋亡因子Caspase-3的表达,促进肺癌细胞的凋亡。3.mi R-210-3p和mi R-630直接作用于TAZ,而并非通过作用TAZ的上游基因MST或LATS间接发挥下调TAZ表达的作用,但mi R-210-3p或mi R-630表达上调或多或少能上调MST和LATS的表达。第二部分:人肺癌TTLL12基因新转录本的发现和鉴定研究背景微管蛋白酪氨酸连接酶12(TTLL12)是TTLL家族中最不具有特征并与家族中其他成员功能不尽相同的成员,其主要功能是在微管蛋白翻译后修饰中具有催化作用。TTLL12与TTLL家族的其他成员相比,在结构中存在差异,相关研究认为TTLL12是具有包含SET样结构域和TTL样结构域这两个非功能结构域且具有保守性缔合的假性酶,而其中包含的这两个域分别与组蛋白甲基化和微管蛋白修饰相关联。最近的研究表明,TTLL12在人类喉癌细胞中可以影响组蛋白甲基化、微管蛋白修饰、有丝分裂持续时间和染色体倍性。此外,有许多研究已经揭示TTLL家族与人类癌症如神经母细胞瘤密切相关。例如,研究发现TTLL家族经常在人类癌症中被抑制,并且与乳腺癌不良预后正相关。而在前列腺癌的研究中,还发现TTLL12表达水平在良性组织增殖层中增加,尤其是在癌症进展至代谢期间表现更明显。这些研究表明,TTLL12可能在其他类型的癌症中也能具有相同的生物学功能模式,并且它可能在肿瘤发生和肿瘤进展中发挥关键作用。目的:1.设计TAZ基因3’RACE引物并扩增出TTLL12基因全长,经基因测序和在线生物信息学软件NCBI BLAST比对分析,发现了TTLL12基因的一种新转录本。2.通过PCR实验、基因测序和NCBI BLAST比对分析验证其他癌症细胞株中是否含有该TTLL12新转录本。3.通过生物信息学方法分析TTLL12基因野生型和TTLL12基因新转录本一级结构和二级结构的区别,同时预测TTLL12基因新转录本的功能。方法:1.提取肺癌细胞株H1299 Total RNA作为模板,使用Takara公司的3’RACE试剂盒扩增出TTLL12基因全长,再经基因测序和在线生物信息学软件NCBI BLAST比对分析。2.发现TTLL12基因的新转录本后,设计两对特异的TTLL12新转录本引物,通过PCR扩增、基因测序和NCBI BLAST验证其他癌症细胞株是否含有TTLL12新转录本。3.生物信息学软件Prot Param和Prot Scale预测分析TTLL12野生型和TTLL12新转录本氨基酸序列一级结构差异。4.生物信息学软件DNASta Proteam和CFSSP预测分析TTLL12野生型和TTLL12新转录本氨基酸序列二级结构差异。5.生物信息软件Dis Port预测TTLL12新转录本的功能。结果:1.肺癌细胞株H1299中发现了TTLL12基因的一种新转录本。2.TTLL12新转录本是在野生型的序列基础上在编码序列(CDS)的902至903位碱基间的位置额外插入了长为108bp的核苷酸序列。3.所有检测的肿瘤细胞株中均可发现TTLL12基因新转录本的表达,并且3个肺癌细胞系(H1299,H2170和Hcc-827)显示出最高的表达量。4.TTLL12新转录本与野生型氨基酸链的一级结构和二级结构均存在差异。5.TTLL12新转录本额外增加的36个氨基酸可能通过作为无序区域的一部分赋予TTLL12新功能。结论:1.本研究发现了TTLL12基因的新转录本,该TTLL12基因新转录本是在TTLL12野生型基因序列902至903个碱基的位置额外插入了长为108bp的核苷酸序列。2.通过验证发现该TTLL12基因新转录本存在于肿瘤细胞株中,特别是肺癌细胞株。3.通过生物信息学分析软件预测TTLL12新转录本与野生型氨基酸链的一级结构和二级结构均存在差异,提示TTLL12新转录本与野生型编码的蛋白功能存在差异。4.进一步研究通过生物信息学分析软件预测TTLL12基因的新转录本中额外插入的核苷酸序列属于无序区域,提示额外插入的核苷酸序列具有潜在的生物学功能。