苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)产生的杀虫晶体蛋白,可以安全有效的杀死农业和卫生害虫。棉铃虫是一种对棉花等多种作物造成严重损害的多食性农业害虫,每年都会给全球农业造成重大的经济损失。世界范围内广泛种植Bt转基因棉来控制棉铃虫等害虫。但是Bt毒素的长期大规模使用导致昆虫对Bt毒素产生了抗性,极大地降低了 Bt转基因作物和Bt产品对害虫的有效防控。关于昆虫对Bt毒素的抗性机制,有些已经明确,如:早期翻译终止;Cry毒素受体的基因表达降低或者Cry毒素与受体的亲和力下降;有些机制尚不明确。前期另一研究组(中国农业科学院植物保护研究所吴孔明老师组)发现,与敏感棉铃虫96S相比,抗性棉铃虫96CAD的Cry1Ac抗性与钙黏蛋白的基因位点密切连锁。通过氨基酸序列比对,发现96CAD中的钙黏蛋白(mHaCAD)与96S(HaCAD)钙黏蛋白有35个差异氨基酸。离体实验表明Cry1Ac毒素与敏感和抗性棉铃虫中钙黏蛋白的结合是相似的,而且钙黏蛋白在两种棉铃虫中的表达在mRNA水平没有显著差异。但是抗性机理尚不清楚。本研究发现mHaCAD蛋白在96CAD中肠上皮细胞刷状缘膜上的分布明显低于96S品系。将96S和96CAD中的钙黏蛋白分别在Hi5细胞中表达,通过免疫荧光技术发现96S-HaCAD蛋白主要分布于细胞膜上,96CAD-mHaCAD蛋白主要滞留在内质网上。通过片段替换,结合免疫荧光技术,发现导致抗性棉铃虫的钙黏蛋白在细胞中差异分布的机制是第172个氨基酸(D172G)发生了突变。这些结果表明钙黏蛋白在细胞中分布的改变,可能导致是细胞对Cry1Ac毒素产生高抗性的原因之一。虽然昆虫的中肠上皮细胞微绒毛膜中缺少钙黏蛋白等受体蛋白,是公认的昆虫对Bt杀虫晶体蛋白产生抗性的机制。但是本研究发现细胞膜上的Bt受体蛋白转运的改变可导致细胞膜上受体的减少,这是以前没有报道的一种新的Bt抗性机制。此外,本文还发现人工缺失敏感棉铃虫钙黏蛋白的不同结构域之后,虽然一些突变体在细胞中的定位没有发生明显的变化,但是如果缺失近膜区,毒素结合区,部分钙离子结合区域,瞬时表达这些突变体的细胞对Cry1Ac毒素的敏感性显著降低。这表明钙黏蛋白的多种突变都可以导致昆虫对Cry1Ac毒素产生高水平抗性。